本文采用HPLC分析啤酒花浸膏中的葎草酮,、合葎草酮、加葎草酮,、蛇麻酮,、合蛇麻酮和加蛇麻酮6種同系化合物，通過優(yōu)化色譜條件,，在等度洗脫條件下實現(xiàn)了其中兩對難分離同分異構(gòu)體的基線分離;收集這6種組分并對其進(jìn)行了紫外(UV)光譜,、紅外(IR)光譜和質(zhì)譜(MS)表征。

1液相色譜儀分析啤酒花浸膏中的 6 種酸性成分的實驗部分

1．1儀器和藥品

P230II高壓恒流泵,，UV230II紫外-可見波長檢測器,，ZW色譜柱恒溫箱;7725i手動進(jìn)樣閥(美國Rheodyne公 司) ;Finnigan液 相 色 譜-質(zhì) 譜 聯(lián) 用 儀(美 國Thermo公司) ;TU-1810APC紫外-可見分光光度計;EQUINOX55型傅里葉變換紅外光譜儀(德國BRUKER公司)。

甲醇,、乙腈、乙醇(色譜純) ;磷酸(分析純) ;實驗用水由Milli-Q純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備;啤酒花浸膏,。

1．2樣品制備

稱取1.0056g浸膏于5mL離心管中,，在30°C水浴中超聲振蕩，用30mL甲醇分多次將樣品轉(zhuǎn)移至50mL燒杯中,，在水浴中超聲振蕩30min后轉(zhuǎn)移至100mL容 量 瓶 中,，用 甲 醇 定 容，充 分 混 勻,。取19.0mL上述溶液于50mL容量瓶中,，用甲醇定容，混勻,，用0.45μm油膜過濾,，濾液供分析。樣品應(yīng)在避光,、低溫條件下保存,。

1．3分析條件

HPLC條件:HypersilODS2色譜柱(250mm×4.6mm，5μm) ,，流動相為乙腈-0.1%(v/v)磷酸水溶液(pH2.2) (65∶35,，v/v) ,，流速為1.0mL/min，檢測波長為315nm,，進(jìn)樣量為20μL,，柱溫為室溫。

UV光譜條件:樣品用乙腈溶解,，掃描波長范圍為199～499nm,。IR光譜條件:將樣品與干燥的KBr粉末按1∶100的質(zhì)量比混合，在瑪瑙研缽中研磨壓片,，掃描范圍為4500～500cm－1,。

MS條件:電離方式為電噴霧電離(ESI) ，離子源溫度為150.00°C,，檢測器電壓為3.05kV,，質(zhì)量掃描范圍為m/z300.00～1000.00，一級全掃描質(zhì)譜分析,。

2液相色譜儀分析啤酒花浸膏中的 6 種酸性成分的結(jié)果與討論

2．1色譜條件的優(yōu)化

2．1．1磷酸的影響

以甲醇-水(含0.26%磷酸或磷酸調(diào)節(jié)pH為2.5)為流動相分析啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸為參考,，考察了酸的加入對HPLC分離啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸的影響。從圖2a中可以看出,，不加酸時色譜峰展寬,，且嚴(yán)重拖尾，分離度低;加入0.1%(v/v)磷酸后目標(biāo)物的出峰時間比不加酸時滯后了3～4min(見圖2b) ,，其原因可能是不加酸時啤酒花浸膏樣品中的有效成分解離,，以離子形式存在，在C18柱中保留相對較弱,，導(dǎo)致出峰提前;加入酸使流動相的酸度增加,，抑制了目標(biāo)物在溶劑中的解離，使目標(biāo)物峰的峰形得到改善,，柱效增加,，樣品的分離度也明顯提高。

2．1．2有機(jī)溶劑的影響

考察了分別以甲醇,、乙醇及乙腈作為流動相中的有機(jī)相對啤酒花浸膏的HPLC分離效果,。從圖3a可知，以甲醇作有機(jī)相時大保留時間大于350min,，且組分2和3沒有達(dá)到基線分離;從圖3b可知,，以乙醇作有機(jī)相時可分出4種組分，分別為合葎草酮(1),、葎草酮與加葎草酮合峰(2+3),、合蛇麻酮(4)、蛇麻酮與加蛇麻酮合峰(5+6) ,，兩對同分異構(gòu)體都沒有得到很好的分離;從圖3c可知,，乙腈的選擇性相對較好,，用其作有機(jī)相時柱壓較小，且6種組分均得到了較好的分離,，兩對同分異構(gòu)體的分離度(Rs)分別為1.58和1.55,，均實現(xiàn)了基線分離，故選擇乙腈作流動相的有機(jī)相,。

2．1．3溫度的影響

在色譜分離中,，色譜柱溫度的改變會影響樣品的分離度及保留時間，故有考察的必要,。研究結(jié)果表明,，溫度每上升5°C，分離時間縮短約5min(以組分5計) ,，兩對同分異構(gòu)體的分離度變化如表1所示,。

柱溫從室溫(25°C)上升到35°C時，組分2和3及5和6的分離度分別下降12.7%和18.7%,，分離度均低于1.5,，不能達(dá)到基線分離的要求［12］;溫度上升到45°C時，組分5和6的分離度下降了約30%,。溫度的升高雖然使保留時間提前,，但分離度相應(yīng)地降低，使兩對同分異構(gòu)體的分離效果變差,，不能達(dá)到基線分離,，故選擇柱溫為室溫。

2．2有效成分的制備與表征

2．2．1有效成分的制備

取1.2節(jié)中所制備的樣品在*分離條件下進(jìn)樣,，按出峰時間收集6種組分(合葎草酮,、葎草酮、加葎草酮,、合蛇麻酮、蛇麻酮,、加蛇麻酮) ,，分別記為I、II,、III,、IV、V和VI,。按1.3節(jié)所述的分析條件分別對收集的6個組分進(jìn)行HPLC分析,，檢測其純度。通過面積歸一化法測得6種組分的純度分別為98.2%,、94.3%,、96.6%,、93.2%、92.6%和90.2%,。

2．2．2結(jié)構(gòu)表征

(1)UV光譜:組分I的UV光譜如圖4所示,，其大紫外吸收波長(λmax)為227nm;從其余5種組分的UV光譜(圖略)可見其λmax分別為222、222,、323,、321和323nm。在320nm左右有強(qiáng)的UV吸收帶說明結(jié)構(gòu)式中有3個共軛雙鍵,，且此處的吸收譜帶說明還有外環(huán)羥基的作用,。羥基是助色基團(tuán)，其與苯環(huán)連接,，形成n-π共軛導(dǎo)致其大吸收波張紅移至220nm左右有大吸收波長;大于270nm處的譜帶是由于結(jié)構(gòu)式中的羰基的紫外吸收所致;在222nm,、227nm處的吸收主要是由于六元環(huán)上的烯醇式-酮式互變作用引起。

(2)IR光譜:組分I的IR光譜見圖5(其余5種組分的IR光譜圖略),。該化合物在3412cm－1的吸收譜帶是羥基的伸縮振動吸收峰;在2975～2840cm－1有3個強(qiáng)吸收譜帶,，說明分子內(nèi)有甲基、次甲基,、亞 甲 基 的C－H對稱與不對稱伸展振動;1467cm－1的譜帶說明分子中含有甲基或乙基;1378cm－1處的吸收譜帶證實有甲基存在;1525～1680cm－1處的一組譜帶是六元環(huán)共軛體系C=C和鄰 接C=O的 伸 縮 振 動 吸 收 區(qū);1200～1000cm－1處的吸收帶表示六元環(huán)上的碳?xì)涿鎯?nèi)的彎曲振動,，說明環(huán)上有鄰、間,、對位取代基,。該表征結(jié)果與其結(jié)構(gòu)吻合。

(3)LC-MS:組分I的質(zhì)譜圖見圖6,，可以看出其準(zhǔn)分子離子峰為m/z348.96;其余5種組分的準(zhǔn)分子 離 子 峰 分 別 為m/z362.92,、362.96、400.94,、414.94,、414.96，6種組分的分子式分別為C20H28O5,、C21H30O5,、C21H30O5、C25H36O4,、C26H38O4,、C26H38O4，MS表征結(jié)果與理論值一致,。

通過UV光譜,、IR光譜和MS對收集的6種組分進(jìn)行表征，結(jié)果與其結(jié)構(gòu)吻合，確認(rèn)所收集的組分I為合葎草酮,，II為葎草酮,，III為加葎草酮，IV為合蛇麻酮,，V為蛇麻酮,，VI為加蛇麻酮。

3液相色譜儀分析啤酒花浸膏中的 6 種酸性成分結(jié)語

建立了HPLC同時測定啤酒花浸膏中6種活性組分的方法,，在等度洗脫下實現(xiàn)了兩對難分離同分異構(gòu)體的基線分離,。該法具有簡便、穩(wěn)定,、分離度好等優(yōu)點(diǎn),，可用于啤酒花浸膏中酸性成分的分析。