細(xì)胞爬片制備詳細(xì)過程

【爬片的準(zhǔn)備】

1.爬片可用一般的蓋玻片,，也可用爬片,；

2.應(yīng)用蓋玻片，可根據(jù)自己的需要剪裁成合適的大小,，以備置于6孔板,、12孔板或24孔板；裁剪時可用前護(hù)士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪,，或者是口腔科的那種小沙輪,，輕輕劃一下后，稍用力一掰就分開了,。

如果接種大皿的話,，我一般不將蓋玻片切開，直接清潔后放入培養(yǎng)皿中,，到染色時再將之切開,，這樣既保證了細(xì)胞均一性，又可同時做幾個指標(biāo)的染色,。

3.將剪裁好的爬片,，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗20遍,，再置于無水酒清中浸泡6小時,，再用三蒸水沖洗3遍（個人認(rèn)為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話,，細(xì)胞帖壁不好）,，放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒,。

4.高壓后取出放入烤箱中烤干，備用,?？靖珊罂煞湃氤瑑襞_中。

5.關(guān)于多聚賴氨酸,，很多人都將玻片用此處理,，以使細(xì)胞與玻片結(jié)合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸,，細(xì)胞貼壁仍然很好,，且在做后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、TUNEL等凋亡檢測,、免疫熒光等也從未脫過片,。

【細(xì)胞爬片】

1.胰酶消化細(xì)胞后計數(shù)重懸細(xì)胞于*培養(yǎng)基中。

2.加細(xì)胞時,，根據(jù)玻片的大小,，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，然后放玻片,，防止加細(xì)胞懸液時玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片,。整個過程注意無菌操作。

3.根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)即可

4.待細(xì)胞貼壁后,，可去上清加含藥培養(yǎng)基,。

5.按照實驗設(shè)計，作用一定時間后取玻片,。取玻片時由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,，張力較大，我一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h,，48h,，72h等這樣時間點的實驗的話，將所需數(shù)量的爬片取出時應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子,。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng),。

【細(xì)胞爬片的固定】

細(xì)胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍,，然后再做固定,。當(dāng)然，根據(jù)研究目的，PBS洗也不是一定要做的,，比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗,，因為凋亡的細(xì)胞在洗的過程中有可能會脫落。

另外在保存細(xì)胞爬片的時候,，我一般用培養(yǎng)皿或板,，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片,，這樣方便做實驗時取片,。然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標(biāo)記,，為避免混淆,，可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的,。

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