技術(shù)原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,，在DNA聚合酶與啟動子的參與下,，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在

聚合酶鏈式反應

實驗中發(fā)現(xiàn),，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性,，并設計引物做啟動子,，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制,。

但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應用和發(fā)展,。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,，PCR技術(shù)得以大量應用,，并逐步應用于臨床。

工作原理

類似于DNA的天然復制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。PCR由變性--退火（復性）--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時

聚合酶鏈式反應

間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備,；②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合,；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，于72℃左右，以dNTP為反應原料,，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,。

工作步驟

標準的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火（復性）（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低,，引物與DNA模板結(jié)合,，形成局部雙鏈。

3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右*的活性）的作用下,，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸,，合成與模板互補的DNA鏈,。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸,，DNA含量既增加一倍,。如圖所示：

現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是*也能在很短的時間內(nèi)復制完成,，因此可以改為兩步法,，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程,，提高了反應速度,。