?                                          生物醫(yī)藥行業(yè)的技術(shù)盛會(huì)

7月17-19日,，由中國(guó)藥學(xué)會(huì)主辦的“第七屆中國(guó)藥學(xué)會(huì)生物技術(shù)藥物質(zhì)量分析研討會(huì)”盛大召開(kāi),，來(lái)自生物醫(yī)藥及科研領(lǐng)域的多位專家及現(xiàn)場(chǎng)近300位行業(yè)人士相聚夏日炎炎的北京，共同探討生物醫(yī)藥行業(yè)內(nèi)的研究進(jìn)展及前沿技術(shù),。

賽默飛色譜質(zhì)譜生物制藥業(yè)務(wù)發(fā)展經(jīng)理唐愷帶來(lái)《基于高分辨質(zhì)譜平臺(tái)的宿主細(xì)胞殘留蛋白（HCPs）檢測(cè)》的解決方案，助力生物醫(yī)藥行業(yè)解決HCPs分析難題,。

賽默飛色譜質(zhì)譜生物制藥業(yè)務(wù)發(fā)展經(jīng)理唐愷

什么是HCPs,？為什么需要關(guān)注HCPs？

重組蛋白類藥物是由遺傳修飾的原核或真核宿主細(xì)胞培養(yǎng)/發(fā)酵產(chǎn)生,，由于細(xì)胞凋亡/死亡/裂解,，其他非必需蛋白質(zhì)也可能釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基/發(fā)酵液中，因此殘留在終產(chǎn)品中的其他蛋白質(zhì)即為宿主細(xì)胞殘留蛋白（HCPs）,。

HCPs的存在會(huì)影響藥物的安全性和有效性,，以及具有蛋白水解活性的HCPs影響藥物產(chǎn)品的穩(wěn)定性，因此生物醫(yī)藥公司不斷優(yōu)化其純化工藝,，從而控制終產(chǎn)品中HCPs的種類和含量,。

現(xiàn)有分析方法有哪些不足,？

目前ELISA方法因其高靈敏度、高通量和易操作優(yōu)勢(shì)成為工業(yè)界的金標(biāo)準(zhǔn),，但仍存在很多限制,。包括：

1.不能對(duì)HCPs進(jìn)行鑒定，低豐度HCPs的檢測(cè)易受限于高豐度蛋白的干擾,；

2.定量動(dòng)態(tài)范圍（3個(gè)數(shù)量級(jí)）較低,，抗體受限，開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng),；

3.無(wú)法改變已有的方法,，缺少校正標(biāo)準(zhǔn)限制定量的準(zhǔn)確性，因此需多種檢測(cè)方法相結(jié)合,。

高分辨質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)性能的不斷提升,，已具有高靈敏度和寬的定量動(dòng)態(tài)范圍，以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,，可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知蛋白質(zhì)的高通量定性和定量,。

Thermo Scientific™ Q Exactive™ Plus

組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀

基于nanoLC-MS/MS高靈敏平臺(tái)的方法，如何對(duì)HCPs進(jìn)行準(zhǔn)確定性和相對(duì)定量呢,？

一,、樣品前處理

2017年禮來(lái)制藥公司Huang, Lihua, et al.在Analytical Chemistry雜志上發(fā)表中的方法是，以NIST抗體標(biāo)準(zhǔn)品為例,，在蛋白質(zhì)非變性的條件下進(jìn)行酶切,，抗體主成分被部分酶切，酶切后經(jīng)90度高溫變性,，未被酶切的部分將被沉淀去除,，從而提高HCPs的鑒定幾率和方法的動(dòng)態(tài)范圍。

我們?cè)诖嘶A(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化,，縮短前處理時(shí)間提高工作效率,，同時(shí)為考察此套流程對(duì)1-100ppm的HCPs的鑒定和相對(duì)定量能力，加入內(nèi)標(biāo)蛋白UPS2（48種蛋白,，6個(gè)不同濃度）進(jìn)行定性和相對(duì)定量,。

圖1.樣品前處理流程示意圖（來(lái)自Huang, Lihua, et al.）

二、儀器,、色譜柱,、數(shù)據(jù)分析軟件

目前根據(jù)液相色譜的流速可分為納升液相色譜（nanoLC,<1µL/min）、毛細(xì)管液相色譜（capillaryLC,1-1µL/min）,、微流速液相色譜（microLC,10-100µL/min）,、分析流速液相色譜（LC,>100µL/min），由于樣品單位濃度和離子化效率依次下降，因此其靈敏度逐漸下降,，本次實(shí)驗(yàn)采用靈敏度zui高的納升液相系統(tǒng),。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.定性結(jié)果：

內(nèi)標(biāo)蛋白UPS2中含有48種內(nèi)標(biāo)蛋白6個(gè)不同濃度,，共鑒定其中24種,，其實(shí)際含量結(jié)果如表1，含量范圍為0.05-444.88ppm,，實(shí)際含量>1ng（10ppm）的16種內(nèi)標(biāo)蛋白全部鑒定到,，實(shí)際含量在0.06-0.38ng（0.6-3.8ppm）范圍內(nèi)共鑒定到6種，此方案的靈敏度足以滿足生物藥領(lǐng)域客戶的需求,。

表1.本次實(shí)驗(yàn)中鑒定到UPS2內(nèi)標(biāo)蛋白的種類及其實(shí)際含量

2.蛋白相對(duì)定量結(jié)果：

本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行HCPs的相對(duì)定量,，采用蛋白TOP3的特異性肽段峰面積的平均值算法，得出每種蛋白的峰面積,，經(jīng)過(guò)三次技術(shù)重復(fù),，對(duì)特異性肽段大于等于1的蛋白峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，平均峰面積分布如圖3A,，峰面積大于1e?的蛋白為此樣品的主抗體,，可看出本實(shí)驗(yàn)定量范圍達(dá)6個(gè)數(shù)量級(jí)。UPS2內(nèi)標(biāo)蛋白的峰面積與含量的分布如圖3B,，峰面積與含量存在一定的線性關(guān)系,， HCPs的相對(duì)含量可根據(jù)其峰面積進(jìn)行初步判斷，進(jìn)而優(yōu)化純化工藝,。

圖3A.特異性肽段大于等于1的蛋白峰面積分布圖

圖3B.內(nèi)標(biāo)蛋白UPS2的峰面積（log2）與其含量的分布

基于UHPLC-MS/MS平臺(tái)的方法：

UHPLC-MS/MS對(duì)于低含量HCPs的檢測(cè)時(shí),，需提高上樣量（至少是納升液相系統(tǒng)的50倍）以提高其靈敏度。

經(jīng)實(shí)例驗(yàn)證此方法同樣滿足當(dāng)前大部分需求,，某抗體藥物的HCPs經(jīng)ELISA定量為5ppm,，UHPLC-MS/MS能夠準(zhǔn)確鑒定到6種HCPs（unique peptides≥2）,通過(guò)內(nèi)標(biāo)UPS2確定其檢測(cè)限達(dá)1ppm，6種HCPs的相對(duì)含量在1-10ppm內(nèi),。

小結(jié)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展,，賽默飛Orbitrap高分辨質(zhì)譜，可采用納升液相,，超液相兩種方式,，定性和相對(duì)定量分析HCPs，LOD均低至1ppm以下,，為傳統(tǒng)的ELISA方法補(bǔ)充更為豐富的信息，進(jìn)一步幫助生物醫(yī)藥企業(yè)優(yōu)化純化工藝,，監(jiān)控終產(chǎn)品和過(guò)程產(chǎn)物中的HCPs含量,。