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原代角質(zhì)形成細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

來源:http://www.icellbioscience.com/news/ScienceContent/1362   2019年07月24日 10:11  

原代細(xì)胞在相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用過程中越來越多,,人們不再單單趨于使用細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,因?yàn)榧?xì)胞系常常由于體外長期培養(yǎng),,而容易丟失原有的生物學(xué)特性,,對藥物處理的反應(yīng)差距越來越大,。
 
原代細(xì)胞剛從組織中分離開,,生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化,,仍保留原來的遺傳特性,也接近和反應(yīng)體內(nèi)生長特性,,原代細(xì)胞的活力和生長狀態(tài)都比較好,,細(xì)胞的純度和基因保留可達(dá)到90%以上,適宜用于藥物敏感性試驗(yàn),、細(xì)胞分化等試驗(yàn)研究,,使用原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),可以獲得更準(zhǔn)確的研究和數(shù)據(jù),。
 
為了更好的服務(wù)于廣大科研工作者,鏡像綺點(diǎn)技術(shù)人員特提供了角質(zhì)形成細(xì)胞分離的常用方法,,技術(shù)因人而異僅供參考:
 
角質(zhì)形成細(xì)胞是一種不斷分化的復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞,,其分化的終階是形成角蛋白。根據(jù)角質(zhì)形成細(xì)胞的發(fā)展階段和特點(diǎn),,從內(nèi)向外可將其分為五層,。基底細(xì)胞層又稱生發(fā)層,,棘細(xì)胞層,,顆粒層,透明層,,角質(zhì)層,。
 
角質(zhì)形成細(xì)胞的分化成熟表現(xiàn)為從基底層到向角質(zhì)層的逐漸移行。在單一移行過程中,,角質(zhì)形成;細(xì)胞的形狀和功能也逐漸發(fā)生著變化,,從單層柱狀上皮的基底層到扁平的細(xì)胞核消失的角質(zhì)層。新生的基底細(xì)胞進(jìn)入棘細(xì)胞層,,然后上移到顆粒層的上層,。細(xì)胞組織來源于實(shí)驗(yàn)動物的正常皮膚組織,細(xì)胞生長狀態(tài)為貼壁培養(yǎng),。
 

 

需要的實(shí)驗(yàn)試劑:
1.培養(yǎng)基1:iCell原代角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系
4.基礎(chǔ)培養(yǎng)基:DMEM/F12
5.緩沖液:無菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S,,pH=7.4
6.消化液1:1.2U/ml的dispase Ⅱ
7.消化液2:0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA
8.消化液3:0.1%Ⅰ型膠原酶
9.75%醫(yī)用酒精
10.胎牛血清(FBS)
 
實(shí)驗(yàn)器械:
1.培養(yǎng)皿
2.T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶
3.100目不銹鋼網(wǎng)篩
4.200目不銹鋼網(wǎng)篩
5.眼科剪
6.眼科鑷
7.離心管(15ml、50ml)
 
實(shí)驗(yàn)步驟:
1.新鮮的包皮組織,,裝盛于含有無菌生理鹽水或1×PBS的無菌容器中,,于保溫盒中,冰上放置離體6h內(nèi)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分離。
2.在無菌環(huán)境中取出包皮組織,,用1×PBS清洗2-3次去除表面血液后,,75%的酒精浸泡100s
3.酒精浸泡組織后快速將組織轉(zhuǎn)入裝有1×PBS的培養(yǎng)皿中震蕩清洗數(shù)次以去除酒精,然后用眼科剪小心剪去皮下組織(脂肪,,微血管等)
4.將去除了脂肪和微血管組織的再用1×PBS清洗幾次后,,剪成3mm*8mm左右的皮片,用消化液1  4度消化過夜(15-18h),。
5.第二天,,用2個眼科鑷子小心撕開過夜消化的皮膚組織,分離和表皮,;
6.分離的表皮用眼科剪剪碎后用消化液3 37度水浴消化1h,。
7.消化完成后用移液器充分吹打100次左右,然后用含血清的培養(yǎng)基終止消化,,過200目不銹鋼網(wǎng)篩后取濾懸液,,轉(zhuǎn)入15ml離心管中,400g離心10分鐘,,離心完成后棄去上清,,沉淀用3ml的1×PBS吹打重懸后,400g離心5min離心完成后棄去上清,,沉淀用2ml的原代角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基吹打重懸后,,轉(zhuǎn)入已經(jīng)裝有2ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中,將培養(yǎng)瓶置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
8.視細(xì)胞貼壁情況48-72h后換液去除未貼壁的細(xì)胞,,之后繼續(xù)培養(yǎng),視細(xì)胞生長狀況和培養(yǎng)基顏色每2-3d換液一次,;待細(xì)胞貼壁率達(dá)到80-90%后,,進(jìn)行常規(guī)傳代擴(kuò)增操作(角質(zhì)細(xì)胞對胰酶不太敏感,消化時間可能會增加到10-15分鐘,,有時需要配合使用無菌細(xì)胞刮鏟進(jìn)行傳代),。
 
除了上述的細(xì)胞分離方法以外,鏡像綺點(diǎn)還有很多關(guān)于其他細(xì)胞的分離方法,,想要學(xué)習(xí)的小伙伴可以來鏡像綺點(diǎn)進(jìn)行現(xiàn)場學(xué)習(xí),,如果想要其他原代分離培養(yǎng)方法,可在購買相應(yīng)的細(xì)胞過程中,,贈送該細(xì)胞的分離方法及培養(yǎng)條件,,想要了解更多,打電話或咨詢相關(guān)工作人員,。

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