液相色譜不能這么用/液相色譜錯(cuò)誤使用方法盤點(diǎn)

上海連橋生物科技有限公司

液相色譜對(duì)于多數(shù)人來(lái)說(shuō)都是很好上手的儀器了，但是就算是用過(guò)幾年,、經(jīng)驗(yàn)豐富的分析員都會(huì)習(xí)慣于一些錯(cuò)誤的操作,，經(jīng)常導(dǎo)致一些儀器故障,。

有時(shí)候?yàn)榱饲罂鞎?huì)忽略一些步驟,，殊不知往往得不償失,！哪些操作不能做,？哪些懶兒不能偷,？那些小概率的故障師傅沒(méi)教怎么辦,？液相使用過(guò)程中有哪四大關(guān)鍵因素要注意,？

1. 流動(dòng)相不過(guò)濾

因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞,、密封環(huán),、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒,。流動(dòng)相在玻璃容器內(nèi)蒸餾,，而常用的方法是濾過(guò)，可采用Millipore濾膜（0.2μm或0.45μm）等濾器,。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）,。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。

2. 使用后沒(méi)有及時(shí)清洗泵

流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì),，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi),，尤其是在停泵過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間的情況下。如果將含緩沖液的流動(dòng)相留在泵內(nèi),，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置,，就可能析出鹽的微細(xì)晶體,，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。

因此,，必須泵入純水將泵充分清洗后,，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（對(duì)于反相鍵合硅膠固定相,，可以是甲醇或甲醇-水）。

3. 流動(dòng)相走空

泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完,，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞,、缸體或密封環(huán),，終產(chǎn)生漏液。

4. 沒(méi)有流動(dòng)相流出,，又無(wú)壓力指示

可能是泵內(nèi)有大量氣體,，這時(shí)可打開(kāi)泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn),，將氣泡排盡,，也可用一個(gè)50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個(gè)可能原因是密封環(huán)磨損,，需更換。

5. 壓力和流量不穩(wěn)

原因可能是氣泡,，需要排除,；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥,，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗,。有時(shí)可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯@時(shí),，可卸下砂濾棒浸入流動(dòng)相內(nèi)超聲除氣泡,，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解,，再立即清洗,。

6. 壓力為啥過(guò)高或過(guò)低

可能是是管路被堵塞,，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏,。檢查堵塞或泄漏時(shí)應(yīng)逐段進(jìn)行,。

在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合,，而且組成不斷變化,，因此帶來(lái)一些特殊問(wèn)題,，必須充分重視：

PS：（在液相色譜中對(duì)組分復(fù)雜的樣品采用梯度洗脫的方法。在同一個(gè)分析周期中,，按一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度配比,，稱為梯度洗脫。從而可以使一個(gè)復(fù)雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達(dá)到良好的分離目的,。

7. 梯度洗脫的流動(dòng)相選擇不當(dāng)

要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相,。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶,，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意,。

當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí),，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心,。

8. 忽略的空白梯度洗脫

梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高,，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫,，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰,，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來(lái)。

用于梯度洗脫的溶劑需*脫氣,，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。

9. 忽略了溶劑混合所帶來(lái)的粘度變化

混合溶劑的粘度常隨組成而變化,，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化,。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多,，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍,。因此要注意防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱能承受的大壓力。

10. 關(guān)于六通閥的正確使用和維護(hù)

①樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45μm濾膜過(guò)濾,，以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損,。

②轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢,，更不能停留在中間位置，否則流動(dòng)相受阻,，使泵內(nèi)壓力劇增,，甚至超過(guò)泵的大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過(guò)高的壓力將使柱頭損壞,。

③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中,，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通?？捎盟疀_洗,，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗,，再用水沖洗,。

11. 關(guān)于色譜柱的使用和維護(hù)

色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要,，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞,。在色譜操作過(guò)程中,，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱,。

12. 調(diào)節(jié)流速太快

避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng),。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）,。

13. 反沖色譜柱

一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì),。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。

14. 預(yù)柱和保護(hù)柱

選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH）,，以避免固定相被破壞,。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí),，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”,，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解,。

避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱,。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱,。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換,。

15. 液相色譜在使用過(guò)程中四大關(guān)鍵因素

① 液相色譜儀本身：

對(duì)于儀器本身一般不會(huì)有問(wèn)題,，特別是剛買回來(lái)的新儀器。對(duì)于儀器本身重要的就是儀器的校驗(yàn),，剛買回來(lái)的儀器一般都是由賣家先對(duì)儀器做系統(tǒng)的確認(rèn)工作（包括IQ,、PQ、OQ）,，確認(rèn)順利通過(guò)后,，再請(qǐng)國(guó)家或省級(jí)儀器檢定局的來(lái)校驗(yàn)，檢定合格后就可以放心使用了,，除此之外,，一些做得好的公司每半年會(huì)對(duì)儀器進(jìn)行一次的內(nèi)部校驗(yàn)，目的就是為了保證儀器的正?？蛇\(yùn)行狀態(tài),。

② 色譜條件：

色譜條件一般包括流動(dòng)相、色譜柱,、檢測(cè)波長(zhǎng),、流速及進(jìn)樣量,。

流動(dòng)相就涉及到配制流動(dòng)相所用到的水和試劑試液,，水一般要求用超純水或其他水的電阻率不大于18.2兆歐級(jí)別,，試劑試液要求用色譜級(jí)別的,，原因?yàn)榉乐顾驮噭┰囈褐械碾s質(zhì)對(duì)色譜結(jié)果的干擾,。

色譜柱會(huì)因不同的品種而有不同的要求，但每根色譜柱都有它的清洗要求,，這個(gè)在色譜柱說(shuō)明書上都可以找到,，一定要根據(jù)上面的要求進(jìn)行，否則會(huì)造成色譜柱效下降和色譜柱的使用壽命縮短,，檢測(cè)波長(zhǎng)也會(huì)因品種的不同有不同的要求,，這里需要指出的是要注意觀察檢測(cè)器氘燈能量的變化，比如基線波動(dòng)大,，活性成分的響應(yīng)值突然變小等,，都有可能是氘燈的能量不足所引起的，氘燈一般建議使用800小時(shí),，但實(shí)際上使用時(shí)間不止,，可根據(jù)實(shí)際情況更換。

流速也因品種的不同而不同,，一般為1.0ml/min,，流速是不可隨意改動(dòng)的，特別是作為QC人員,，但是作為研發(fā)人員,，有時(shí)為了摸索條件或進(jìn)行方法耐用性驗(yàn)證，會(huì)對(duì)流速進(jìn)行改變以評(píng)價(jià)方法的適用性,。對(duì)于進(jìn)樣量因不同的品種也有不同規(guī)定，進(jìn)樣量這塊現(xiàn)在都使用自動(dòng)進(jìn)樣,，所以進(jìn)樣精密度都很好,，不需強(qiáng)調(diào)什么。

③ 操作人員：

首先,，作為液相操作人員,，一定要認(rèn)真學(xué)習(xí)夜想的說(shuō)明書，掌握液相硬件和軟件的操作,，掌握日常的維護(hù)保養(yǎng)，掌握基礎(chǔ)故障的排除和維修,。

一般液相的操作規(guī)程也是有操作人員起草的,，所以只要嚴(yán)格按照操作要求進(jìn)行操作，一般不會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題,，當(dāng)然啫喱需要特別指出的是對(duì)于液相的日常維護(hù)保養(yǎng)很重要,，比如流動(dòng)相的過(guò)濾、脫氣,、泵密封墊的清洗,、系統(tǒng)管路的清洗、溶劑過(guò)濾頭的清洗等,，倘若不堅(jiān)持,，很容易導(dǎo)致色譜柱堵塞,、系統(tǒng)壓力過(guò)大,、譜峰異常等不必要的故障,，浪費(fèi)時(shí)間,。

其次，操作人員在配制液相分析用樣品溶液時(shí),，建議由同一個(gè)人單獨(dú)完成,，以免不必要的偶然誤差。

④ 液相安裝環(huán)境：

液相色譜儀應(yīng)盡量安裝于水平,、遠(yuǎn)離振動(dòng),、電磁干擾的屋內(nèi)的臺(tái)面上，有條件的話盡量將液相數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分隔開(kāi),，一個(gè)是防止色譜基線噪音偏大,，基線不穩(wěn)等,，一個(gè)是為減少對(duì)人體的危害。

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