PCR雖然為一個(gè)簡單的實(shí)驗(yàn),，但在實(shí)際過程中可能會(huì)出現(xiàn)各種問題,。產(chǎn)生問題的原因可能來源于以下幾個(gè)方面：實(shí)驗(yàn)操作，試劑質(zhì)量,，PCR反應(yīng)過程中各種試劑的含量,，以及反應(yīng)條件，溫度設(shè)置等,，本文對各個(gè)方面進(jìn)行了討論,，大家遇到問題后可以對號(hào)入座的查一下。當(dāng)然，具體問題的解決還依靠實(shí)驗(yàn)者就可能的原因逐項(xiàng)排除,，并不斷的摸索才能*解決,。

假陰性,，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 

       PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及,，④PCR循環(huán)條件,。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。 

      模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì),，②模板中含有Taq酶抑制劑,，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白,，④在提取制備模板時(shí)丟失過多,，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不*,。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理,，模板核酸提取過程出了毛病,，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改,。 

     酶失活：需更換新酶,，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性,。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠,。 

     引物：引物質(zhì)量、引物的濃度,、兩條引物的濃度是否對稱,，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因,。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題,，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低,，造成低效率的不對稱擴(kuò)增,，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶,，一條引物無條帶,，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高,，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度,。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效,。④引物設(shè)計(jì)不合理,，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等,。 

     Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶,。 

     反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul,、30ul、50ul,?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí),，一定要模索條件,，否則容易失敗。 

     物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,，如變性溫度低,，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率,。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性,、退火和延伸溫度,，這也是PCR失敗的原因之一。 

     靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合,，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。  

假陽性 

     出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,，有時(shí)其條帶更整齊,，亮度更高。   引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽性,。需重新設(shè)計(jì)引物,。

       靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外,。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒,。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用,。必要時(shí)，在加標(biāo)本前,，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,，這些小片段比靶序列短,，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來減輕或消除。  

出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 

       PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,，或大或小,，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不*互補(bǔ),、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn),，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,。其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù),。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,，65℃左右退火與延伸)。 

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 

     PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差,，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高,，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量,，或調(diào)換另一來源的酶,。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度,。增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)。 

克隆PCR產(chǎn)物 

1)克隆PCR產(chǎn)物的理想條件是什么,？ 

插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定,。1：1（插入片段：載體）常為理想比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行,。應(yīng)測定比值范圍,。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul,。室溫保溫1小時(shí),，或4℃過夜。在這2種溫度下,，缺T-凸出端的載體會(huì)自連,，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求,，為提高連接效率,，需4℃過夜。 

2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化,？ 

如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶,，不需要用凝膠純化,。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體,。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高,，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段,。為此需在克隆前做凝膠純化,。  

3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實(shí)驗(yàn),？ 

A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞,。 

如有菌落，表明氨芐失效,，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒,，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。 

B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒,，計(jì)算菌落生長數(shù),，測定轉(zhuǎn)化效率,。 

例如,，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后,，用100ul鋪板,。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落,。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量,。 

鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA,，用SOC

稀釋到1000u后含10ng DNA,，用1/10鋪板，共用1ng DNA,。轉(zhuǎn)化率為： 

1000克隆X10（3次方）ng /鋪板1ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞 如沒有菌落或少有菌落,，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。 

C）如用pGEM-T正對照,，或PCR產(chǎn)物,，產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T,?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801,，M1804,，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染,，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。

D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體,，連接pGEM-T正對照,，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落,，其中60%應(yīng)為白斑,，如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題,。 

4)對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好,，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題,？ 

A）連接用室溫保溫1小時(shí),，能滿足大多數(shù)克隆，為提率,，需4℃過夜,。

B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失,，或抑制連接,，抑制轉(zhuǎn)化。為此,，將插入片段和pGEM-T正對照混合,，再連接。如降低了對照的菌落數(shù),，插入片段需純化,，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑,，插入片段污染有核酸酶,，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。 

C）插入片段不適于連接,。用凝膠純化的插入片段,，因受UV過度照射，時(shí)有發(fā)生,。UV過度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體,，不利于連接，DNA必需重新純化,。 

D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A,，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A,。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）,。 

E）高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定,，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排,，需用重組缺陷大腸桿菌菌株,，如SURE細(xì)胞   

PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 

10×擴(kuò)增緩沖液         10ul 

4種dNTP混合物       各200umol/L 

引物               各10～100pmol/L         

模板DNA           0.1～2ug         

Taq DNA聚合酶       2.5u         

Mg2+            1.5mmol/L        

加雙或三蒸水至        100ul 

PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶,、dNTP,、模板和Mg2+  

      引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度,。理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增,。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： 

①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右,。 

②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜,，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。 

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。 

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ),，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物

二聚體,，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶,。 

⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,，應(yīng)嚴(yán)格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。 

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),， 被擴(kuò)增的靶序列應(yīng)該有適宜的酶切位點(diǎn),， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。 

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì),。酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng),，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶,。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)),，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少,。 

     dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性,。dNTP溶液呈酸性,，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris,。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5,，小量分裝，-20℃冰凍保存,。多次凍融會(huì)使dNTP降解,。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L,，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配,。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量,。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低,。 

     模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本,。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白,，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀,；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,，再用有機(jī)溶劑酚與三氯甲烷抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng),。一般臨床檢測標(biāo)本,，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體,，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,，直接用于PCR擴(kuò)增,。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA,。 

    Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜,。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低,，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少,。  

     PCR反應(yīng)條件的選擇 

     PCR反應(yīng)條件為溫度,、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。 

     溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn),。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法,，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃,，引物退火并結(jié)合到靶序列上,，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下,，使引物鏈沿模板延伸,。對于較短靶基因(長度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外,、退火與延伸溫度可合二為一,，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性),。 

①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低,，解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的主要原因。一般情況下,，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時(shí)間,，但溫度不能過高,，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性,，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗,。

②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合,。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間,，取決于引物的長度,、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度,。對于20個(gè)核苷酸,，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇適退火溫度的起點(diǎn)較為理想,。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： 

    Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T) 

    復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允許范圍內(nèi),，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性,。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec,，足以使引物與模板之間*結(jié)合。

③延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：          

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子          

70℃ 60核苷酸/S/酶分子          

55℃ 24核苷酸/S/酶分子 

高于90℃時(shí),，DNA合成幾乎不能進(jìn)行,。 

     PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃,，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合,。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,，延伸時(shí)間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min,；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min,。延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增,，延伸時(shí)間要稍長些,。