個要給大家講的,，是它這個flowcell,。Flowcell翻成中文，就叫“流動池”,。

我們來看這個圖片,。圖片當(dāng)中，我們看到一個象載玻片大小的芯片,。這個芯片里面,，是做了8條通道。在這個通道的內(nèi)表面,，是做了專門的化學(xué)修飾,。它的化學(xué)修飾，主要是用2種DNA引物,，把它（2種DNA引物）種在玻璃表面,。

這兩種（DNA引物的）序列是和接下來要測序的DNA文庫的接頭序列相互補(bǔ)的。而且這2種引物是通過共價鍵,，連到Flowcell上去,。之所以要用共價鍵連到Flowcell上去，是因為接下來有大量的液體要流過這個Flowcell,，只有有共價鍵連接的這些DNA,，才不會被沖掉。這就是Flowcell,。

文庫制作

再接下來,，講一下文庫、和文庫的制作（過程）所謂的DNA文庫,，實際上是許多個DNA片段,，在兩頭接上了特定的DNA接頭，型成的DNA混合物,。

文庫有2個特點,，第1個特點，是當(dāng)中這一段插入的DNA,，它的序列是各種各樣的,。第2個特點，它的兩頭的接頭序列,，是已知的,，而且是人工特地加上去的。要做這個文庫,，首先是把基因組DNA,，用超聲波打斷。然后打斷之后,，兩頭用酶把它補(bǔ)平,，再用Klenow酶在3'端加上一個A堿基,。然后，再用連接酶把這個接頭給連上去,。

連好了接頭的DNA混合物,，我們就稱為一個“文庫”。英文也稱作“library”,。

橋式PCR

做好了Library之后,，就要做橋式PCR了。橋式PCR,，實際上是把文庫種到芯片上去,，然后進(jìn)行擴(kuò)增，這樣的一個過程,。

這個過程,，首先是把文庫加入到芯片上，因為文庫兩頭的DNA序列,，和芯片上引物是互補(bǔ)的,，所以，就會產(chǎn)生互補(bǔ)雜交,。

雜交完了之后,，我們在這里面加入dNP和聚合酶。聚合酶會從引物開始,，延著模板合成出一條全新的DNA鏈來,。

新的這條鏈，和原來的序列是*互補(bǔ)的,。

接下來,，我們再加入NaOH堿溶液。DNA雙鏈在NaOH堿溶液存在下,，就解鏈了,。而且被液流一沖，原來的那個（模板）鏈,，也就是沒有和芯片共價連接的鏈，就被沖走了,。而和芯片共價連接的鏈,，就被保留下來。

然后,，我們再在液流池里加入中性液體,，主要是為了中和這個堿液，在加入中和液之后,，整個環(huán)境變成中性了,。這時侯,，DNA鏈上的另外一端，就會和玻璃板上的第二種引物,，發(fā)生互補(bǔ)雜交,。

接下來，我們加入酶和dNTP,，聚合酶就延著第二個引物,，合成出一條新鏈來；然后,，我們再加堿,，把2條鏈解鏈解開；然后,，我們再加中和液,，這時侯，DNA鏈會和新的引物雜交,。再加酶,，再加dNTP，又從新引物合成出新的鏈來,。

連續(xù)重復(fù)這一過程,，DNA鏈的數(shù)量，就會以指數(shù)方式增長,。

制備單鏈

在橋式PCR完成之后,，接下來要做的工作，就是要把合成的雙鏈,，變成可以測序的單鏈,。

辦法是通過一個化學(xué)反應(yīng)，把其中一個引物上的一個特定的基團(tuán)給切斷掉,。

然后,，再用堿溶液來洗這個芯片。這時侯,，堿讓DNA的雙鏈解鏈,，那根被切斷了根的DNA鏈就被水沖掉了。留下那根共價鍵連在（芯片）上面的鏈,。

接下來,，再加入中性溶液，然后在這個中性溶液里面加入測序引物,。

正式測序

好,，接下來正式的測序工作就開始了。

那么，在測序的時侯,，加入進(jìn)去的,，主要是2個東西：一個是帶熒光標(biāo)記的dNTP。而這個dNTP,，它還有一個特點,，它的3'末端是被一個疊氮基堵住的。

然后,，再加一個聚合酶,，聚合酶就會選擇：哪一個dNTP是和原來位置上的那個堿基是互補(bǔ)的，根據(jù)互補(bǔ)性原理,，把這個dNTP合成到新的這個DNA鏈上去,。

因為這個dNTP的3'端是被一個疊氮基團(tuán)堵住了，所以,，它一個循環(huán)只能延長一個堿基,。然后，它就停在那兒了,。

合成完了之后,，就用水把多余的dNTP和酶給沖掉。

沖掉之后,，就放到顯微鏡下,，去進(jìn)行激光掃描。根據(jù)發(fā)出來的熒光來判斷它是哪個堿基,。

因為4種dNTP,，它每一種dNTP上面標(biāo)的熒光素都不一樣，根據(jù)紅,、黃,、藍(lán)、綠,，它出來的哪種顏色,，那么，就可以倒過來推出來,，這個新合成上去的堿基,，是哪種堿基。

因為新合成的堿基,，是和原來位置（的堿基）是互補(bǔ)的,，所以，又推出模板上那個堿基是哪個,。

這一個循環(huán)完成之后，就加入一些化學(xué)試劑，把疊氮基團(tuán)和旁邊標(biāo)記的熒光基團(tuán)切掉,。切完了之后,，3'端的羥基就暴露出來。

再接下來,，加入新的dNTP和新的酶,，然后，又延長一個堿基,。新延長完一個堿基之后,，把多余的酶和dNTP沖掉，再進(jìn)行一輪顯微的激光掃描,，再讀一下這個堿基是什么,。

不斷重復(fù)這個過程，可以重復(fù)上百次,，到幾百次,，就可以把上百個堿基，甚至更多堿基的序列讀出來,。

讀Index

那么,，什么是Index哪？是因為Illumina的評委會個測序量很大,，往往一個樣本,，用不了那么幾億條DNA。所以,，科學(xué)家就想了一個辦法,。在文庫的接頭上做了一些標(biāo)記，每一個樣本,，它有一個特定的接頭,，每個接頭里面，它有一段特定的序列,。

這段特定的序列,，我們就稱為Index。也有人把它叫做Barcode,，反正,，表達(dá)的是一個意思：這么一段特定的序列，標(biāo)記了樣本的來源,。

那么,，要讀這個Index的序列，先用堿把上面這根測完“Read1”的序列,，把上面這根DNA鏈給解鏈掉,。

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