上期小奧課堂和大家講了《ELISA方法學(xué)開(kāi)發(fā)實(shí)踐版-生物大分子檢測(cè)的定量方法開(kāi)發(fā)》,。
本期小奧再和大家分享另一個(gè)重要話題：《ELISA方法學(xué)開(kāi)發(fā)實(shí)踐版-親和力測(cè)定方法開(kāi)發(fā)》,。

一,、前言

目前用于測(cè)定受體配體間的親和力，也就是解離平衡常數(shù)的方法,，主要有：

1. 熱力學(xué)測(cè)定方法
2. 動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法
3. 飽和濃度法

其中動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法和飽和濃度法較為通用：動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法（如Biacore）涉及到比較昂貴的儀器投入,，飽和濃度測(cè)定法為國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)生物藥物企業(yè)常用的測(cè)定方法。

ELISA用于親和力的測(cè)定是飽和濃度測(cè)定法的主流模式,，常用于抗原蛋白或者抗體的蛋白水平的活性評(píng)估和抗體的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)等,。
ELISA用于親和力測(cè)定往往沒(méi)有商業(yè)化的試劑盒，需要實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行方法學(xué)開(kāi)發(fā),。

由于生物技術(shù)這方面教育缺失和新藥研發(fā)企業(yè)在此應(yīng)用的積累不夠,，一個(gè)能夠通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證的ELISA親和力測(cè)定方法對(duì)于很多從業(yè)人員來(lái)說(shuō)是一件難度較大的事情，而且很有可能出現(xiàn)謬誤如新號(hào)傳遞錯(cuò)誤或者偏差等,。
其中的一個(gè)謬用是采取ELISA定量的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行ELISA親和力測(cè)定方法的開(kāi)發(fā),。

本文從親和力的測(cè)定方法的基本原理入手，描述飽和濃度法親和力測(cè)定的基本原則,，概述ELISA方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中的抗原抗體的劑量關(guān)系,，以及在ELISA用于親和力測(cè)定方法應(yīng)用時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)的幾個(gè)錯(cuò)誤，并為大家介紹通用的親和力測(cè)定的方案和初步的方法學(xué)開(kāi)發(fā)的方案,。

二,、親和力基本概念

我們通過(guò)分析幾個(gè)化學(xué)反應(yīng)案例，和大家解釋一下什么叫做親和力,。

 例子A 
氫氣和氧氣在點(diǎn)燃的條件下生成水,。
在反應(yīng)停止時(shí)，如果在反應(yīng)環(huán)境中氫氣的摩爾濃度恰巧是氧氣的摩爾濃度的2倍時(shí),，兩者皆被消耗,，反應(yīng)環(huán)境中只有水,；如果氫氣的摩爾濃度大于氧氣的摩爾濃度的2倍時(shí)，氧氣被消耗,，反應(yīng)環(huán)境中只有氫氣和水,；果氫氣的摩爾濃度小于氧氣的摩爾濃度的2倍時(shí)，氫氣被消耗,，反應(yīng)環(huán)境中只有氧氣和水,。
這是關(guān)于化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)知識(shí)，化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的結(jié)果,，反應(yīng)物能夠變?yōu)樯晌?，即反?yīng)能進(jìn)行到底，有此類反應(yīng)的過(guò)程和結(jié)果特性的反應(yīng)稱之為不可逆反應(yīng),。

 例子B 
PD1抗原（CD279）和PD1抗體（如pembrolizumab）在常溫常壓下反應(yīng),。
在反應(yīng)停止時(shí)，如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為200nM, pembrolizumab的摩爾濃度是100nM時(shí),，在理想條件下pembrolizumab-CD279復(fù)合物的濃度為97.86nM, CD279的摩爾濃度為4.28nM, pembrolizumab為2.14nM; 
如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為100nM, pembrolizumab的摩爾濃度是200nM時(shí),，在理想條件下pembrolizumab-CD279復(fù)合物的濃度為49.81nM, CD279的摩爾濃度為0.38nM, pembrolizumab為159.19nM。

 例子C 
PD1抗原（CD279）和PDL1抗原（CD274）在常溫常壓下反應(yīng),。
如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為200nM, CD274的摩爾濃度是100nM時(shí),，在反應(yīng)完成時(shí)理想條件下CD274-CD279復(fù)合物的濃度為2.35nM, CD279的摩爾濃度為197.65nM，CD274的摩爾濃度是97.65nM,；
如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為100nM, CD274的摩爾濃度是200nM時(shí),，在反應(yīng)完成時(shí)理想條件下CD274-CD279復(fù)合物的濃度為2.35nM, CD279的摩爾濃度為97.65nM，CD274的摩爾濃度是197.65nM,，絕大多數(shù)CD279和CD274并未參與反應(yīng),。
案例B、C兩種情況下,，無(wú)論是抗原和抗體（配體和受體）結(jié)合反應(yīng),，兩者反應(yīng)有生成復(fù)合物的正反應(yīng)過(guò)程，也有復(fù)合物解離反應(yīng)生成抗原,、抗體逆反應(yīng)過(guò)程,，終的結(jié)果是抗原，抗體和抗原-抗體復(fù)合物三者共存的狀態(tài),。

這樣的反應(yīng)稱之為可逆反應(yīng),。
當(dāng)一個(gè)可逆反應(yīng)中正反應(yīng)和逆反應(yīng)的速度相等時(shí)，反應(yīng)體系中抗原的濃度,、抗體的濃度和抗原-抗體復(fù)合物濃度不再增加也不再減少,，可逆反應(yīng)完成，反應(yīng)體系中各成分摩爾濃度處于動(dòng)態(tài)平衡。

親和力(Affinity)是可逆反應(yīng)過(guò)程中抗原,、抗體和抗原-抗體復(fù)合物之間的相對(duì)狀態(tài)的特征參數(shù),，其更加專業(yè)性和術(shù)語(yǔ)化的名稱是解離平衡常數(shù)KD，單位mol/L(和濃度單位一致),。

親和力數(shù)值越小則親和力越強(qiáng),，親和力的強(qiáng)弱決定了終決定反應(yīng)完成時(shí)可逆反應(yīng)各組分相對(duì)多少。

如例子B和C同樣是和200nM CD279（PD1）反應(yīng),，抗體pembrolizumab (PD1抗體)相對(duì)于CD279的親和力為0.4nM, 配體CD274（PDL1）相對(duì)于CD279的親和力為8200 nM,終反應(yīng)生成的pembrolizumab-CD279復(fù)合物是97.86 nM,而CD274- CD279復(fù)合物僅僅只有2.35nM,，兩者相差42倍。

有別于不可逆反應(yīng),，除了抗原抗體的摩爾濃度外,，抗原和抗體（配體和受體）兩者間的親和力將極大的影響可逆反應(yīng)中生成物的多少,。

三,、你知道ELISA進(jìn)行方法學(xué)開(kāi)發(fā)時(shí)的基本原則嗎？

對(duì)于親和力測(cè)定方法和原理的概述,，讀者可參考生物功能學(xué)篩選評(píng)價(jià)技術(shù)之親和力評(píng)價(jià)篇,。
本文主要對(duì)飽和濃度法進(jìn)行概括。
R代表受體或抗原,，L代表配體或抗體,。
采用飽和濃度法，如果要測(cè)定配體相對(duì)于受體的親和力,，少量R存在的情況下,，將L進(jìn)行梯度稀釋，檢測(cè)R-L復(fù)合物的濃度,，當(dāng)R-L復(fù)合物的濃度占總R濃度的一半時(shí),，L對(duì)應(yīng)的濃度值（EC50）即L相對(duì)于R的KD值。
RL復(fù)合物/R即B值可用檢測(cè)的信號(hào)值代替,，梯度稀釋的L和信號(hào)之間的函數(shù)關(guān)系滿足下面的公式,，只有在此在特定的實(shí)驗(yàn)條件下EC50值能夠等價(jià)于KD值。
飽和濃度法測(cè)定KD值有幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),，即相互作用的兩個(gè)分子,，R要少量，L要進(jìn)行連續(xù)的梯度稀釋,，需要得到的信號(hào)響應(yīng)值（所有的R的結(jié)合位點(diǎn)被L占據(jù)）即平臺(tái)期,，那么在此條件下，占據(jù)一半R時(shí),，所需要的L濃度（EC50）為KD值,。
飽和濃度法主要測(cè)定的是代表RL復(fù)合物的信號(hào)值，測(cè)定方法可以是流式細(xì)胞術(shù)、同位素標(biāo)記術(shù),、熒光偏振,，也可以是ELISA。

四,、用于親和力測(cè)定的ELISA方法學(xué)開(kāi)發(fā)常用方法

布局

一般操作流程

01 酶標(biāo)板的制備：取濃度為100 ug/ml抗原,，室溫溶解，混勻用包被液按如下步驟稀釋至0.2ug/ml,，0.5ug/ml,，1ug/ml，按加樣布局表加入100ul/孔,，分別加入酶標(biāo)板條中(Note 1),，其中加入包被液做包被抗體的對(duì)照，2-8℃過(guò)夜,；
02用洗滌液洗板3次,，拍干，加入300ul/孔封閉液(Note 2)室溫封閉1小時(shí),；洗滌液洗板3次,，拍干待用；
03 按照布局將抗體以100000ng/ml起始3倍梯度稀釋（Note 3）,，按照布局,，100ul/孔加入微孔板中；
04放入奧豪斯微孔板振蕩器 (ISLDMPHDG)內(nèi),，設(shè)置37℃,、600rpm振蕩1小時(shí)；  

05用洗滌液洗板3次,，拍干,；
06酶聯(lián)抗體稀釋到合適的濃度（Note 4），在奧豪斯渦旋儀（VXMNFS）上混勻,，100ul/孔,；

07放入微孔板振蕩器內(nèi)，設(shè)置37℃,、600rpm振蕩1小時(shí),；    
08用洗滌液洗板4次，拍干,；
09取酶聯(lián)抗體對(duì)應(yīng)的顯色液,，臨用前20分鐘拿出平衡到室溫，在漩渦混合器上混勻,；
10使用8道排槍以100 ul/孔加入顯色液,；
11顯色液室溫避光放置10-30分鐘 （Note 5）,；
12使用8道排槍以100 ul /孔加入終止液終止反應(yīng)（根據(jù)底物的不同，此步驟可能不需要）,；
13用酶標(biāo)儀測(cè)定信號(hào)值（Note 6）,；
14結(jié)果分析（Note 7）。 

貼心小NOTE

Note1：如果需要減少反應(yīng)過(guò)程中高濃度的抗體（100000ng/ml）對(duì)酶標(biāo)板材的非特異吸附,，在包被過(guò)程中,，建議選擇疏水性酶標(biāo)板材（polysorp）,包被的抗原濃度需要少量0.2-1ug/ml，具體情況需要根據(jù)抗原抗體的親和力大小來(lái)進(jìn)行判斷優(yōu)化,。一般來(lái)說(shuō)親和力越強(qiáng),，所需的抗原包被濃度越低。
Note2：封閉液不一定能起到封閉效果,，需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（未包被抗原的分組）,，一般來(lái)講分子量越小的封閉劑效果越佳。
Note3：在方法學(xué)開(kāi)發(fā)的初期可以拉大一下標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍100000ng/ml-0.1ng/ml,，以得到有明顯上下平臺(tái)期的全曲線,，當(dāng)抗原抗體間親和力較強(qiáng)時(shí)，梯度濃度可縮小,，稀釋的倍數(shù)可在方法學(xué)優(yōu)化過(guò)程中縮小至2倍,。
Note4：酶聯(lián)抗體效應(yīng)過(guò)量，酶聯(lián)抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進(jìn)行比較選擇,，對(duì)于單抗成分的酶聯(lián)抗體，如果高低兩個(gè)稀釋度的酶聯(lián)抗體能夠產(chǎn)生一樣的劑量曲線,，說(shuō)明酶聯(lián)抗體過(guò)量,，ELISA的信號(hào)傳遞未產(chǎn)生偏差。
對(duì)于多抗成分的酶聯(lián)抗體,，其稀釋度的判斷較為復(fù)雜,，可以初略計(jì)算下酶聯(lián)抗體的摩爾濃度要高于包被上的抗原摩爾濃度的5倍以上。當(dāng)酶聯(lián)抗體濃度較小時(shí),，酶聯(lián)抗體在高劑量不同濃度的抗體條件下均被抓到,，曲線有假上平臺(tái)。
Note5：對(duì)于吸光度值底物和熒光底物,，儀器檢測(cè)的信號(hào)值和顯色時(shí)間成正比,，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認(rèn)檢測(cè)儀器的信號(hào)線性范圍,，比如一般的酶標(biāo)儀吸光度值的信號(hào)線性范圍在0-3,，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時(shí)應(yīng)控制信號(hào)值不要超過(guò)3,，當(dāng)信號(hào)值超過(guò)線性范圍時(shí),，曲線有假上平臺(tái),。
Note6：不同底物需要用不同的儀器進(jìn)行檢測(cè)，吸光度讀值,，熒光讀值,，化學(xué)發(fā)光讀值。在底物選擇過(guò)程中注意實(shí)驗(yàn)室的酶標(biāo)儀是否具備該種類型的讀數(shù)功能,。
Note7：標(biāo)準(zhǔn)的劑量曲線擬合一般用四參數(shù)擬合,，需要有明顯的上下平臺(tái)期（A，D值）,，斜率一般在0.8-1.2（B值）之間,，EC50（C值）即為抗體相對(duì)于抗原的親和力值。

五,、總結(jié)

根據(jù)飽和濃度法,，采用ELISA進(jìn)行親和力測(cè)定時(shí)，需要有明顯的四參數(shù)S型曲線,，即需要有隨抗體濃度漸進(jìn)變化的信號(hào)曲線,。
在抗體低濃度和高濃度時(shí)有明顯的上下平臺(tái)期，上平期信號(hào)值的一半對(duì)應(yīng)的抗體濃度（EC50）值即抗原抗體間親和力KD值,。
由于儀器的檢測(cè)信號(hào)的線性范圍是有限,，當(dāng)信號(hào)超過(guò)線性范圍時(shí)會(huì)使曲線進(jìn)入假上平臺(tái)期使得測(cè)得的親和力不準(zhǔn)。
包被的抗原濃度直接決定了信號(hào)的信號(hào)值,，所以在用ELISA進(jìn)行親和力測(cè)定時(shí),，包被的抗原濃度盡量要小，以得到合適的信號(hào)值,；酶聯(lián)抗體濃度過(guò)低時(shí)也可能使曲線進(jìn)入假平臺(tái)期,。

在ELISA方法學(xué)開(kāi)發(fā)過(guò)程中，酶聯(lián)抗體過(guò)量以信號(hào)的線性傳遞需要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,。
當(dāng)信號(hào)無(wú)法得到有效的上平臺(tái)期時(shí),，說(shuō)明抗原抗體間的親和力太弱或者包被抗原過(guò)多，需要更大濃度的抗體才能使得所有抗原被抓住以達(dá)到平臺(tái)期,。
受限于ELISA靈敏度的限制,，在一些親和力較弱（>100nM）的抗體抗原中，采用ELISA方法基本得不到有效的平臺(tái)期,，也無(wú)法測(cè)得的親和力數(shù)值,。
ELISA進(jìn)行親和力測(cè)定評(píng)價(jià)抗原的活性或者測(cè)定抗體活性時(shí)，得到的EC50并非越小越好,，信號(hào)進(jìn)入假平臺(tái)期（達(dá)到儀器的檢測(cè)極限,，酶聯(lián)濃度較小）均會(huì)使EC50變小,，從而得到錯(cuò)誤的親和力數(shù)據(jù),，這也是ELISA進(jìn)行親和力測(cè)定時(shí)容易產(chǎn)生的謬誤,。
如今很多抗原蛋白的供應(yīng)商關(guān)于抗原活性的評(píng)價(jià)均存在此類謬誤。

抗原和抗體間的親和力是有兩者的結(jié)構(gòu)和相互作用決定的,，可能是0.1 nM,1 nM或者1000 nM,。評(píng)價(jià)ELISA親和力測(cè)定方法的好壞需要看此EC50值是否和親和力的值相符，親和力的值可通過(guò)熱力學(xué)測(cè)定方法,，動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法和飽和濃度法中的細(xì)胞流式測(cè)定法等多方面驗(yàn)證,。
反過(guò)來(lái)說(shuō)當(dāng)一個(gè)ELISA方法不存在諸如信號(hào)進(jìn)入假平臺(tái)期（達(dá)到儀器的檢測(cè)極限，酶聯(lián)濃度較?。?/span>等謬誤時(shí),，其EC50值才能真實(shí)的反應(yīng)親和力的數(shù)值。

采用ELISA進(jìn)行方法學(xué)開(kāi)發(fā)需要明確應(yīng)用目的,，大分子定量和親和力測(cè)定,。
不同的應(yīng)用目的，抗原和抗體的相對(duì)劑量濃度會(huì)有很大的差異,，有不同的劑量曲線,，讀者可以結(jié)合上篇《ELISA方法學(xué)開(kāi)發(fā)實(shí)踐版-生物大分子檢測(cè)的定量方法開(kāi)發(fā)》進(jìn)行對(duì)比研究，明晰差異,。

本期分享就到這里啦,，我們下期再會(huì)喲！

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