1對(duì)于一根常用的C18柱,，拿到一根新柱的時(shí)候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)？為什么要這樣做,？

　　答：新柱活化,，實(shí)際上是一個(gè)平衡的過(guò)程,，除了用流動(dòng)相平衡外，有時(shí)候還必須用所測(cè)樣品對(duì)新柱進(jìn)行平衡,，特別是測(cè)定分子量比較高的多肽,，尤其重要。因?yàn)榉肿恿扛叩奈镔|(zhì)分子,，擴(kuò)散速度慢,，平衡所需時(shí)間也相應(yīng)較長(zhǎng)。具體平衡方式也很簡(jiǎn)單,，多進(jìn)幾次樣品,，直到峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定，再進(jìn)行正式進(jìn)樣測(cè)定,。

　　如果要加快平衡時(shí)間,，把前面用來(lái)平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大，或者不等洗脫完成,，連續(xù)進(jìn)樣多針,。用待測(cè)物對(duì)新柱平衡，目的是將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點(diǎn)的吸附能力飽和掉,。

2測(cè)定多肽,，一般采用什么柱子？流動(dòng)相是乙腈和水,，還有微量的TFA,。特別是像類(lèi)似三肽的短肽，應(yīng)該怎么選擇柱子,？

　　答：分子量不高的多肽一般選用常規(guī)C18柱就能測(cè)定,，也有用離子交換柱、水性C18柱和Hilic親水作用柱的,。

3氨基柱在進(jìn)酸性樣品時(shí),，很傷柱子，如使用一段時(shí)間后,，柱效降低,，峰形改變，如何恢復(fù),？

　　答：氨基柱測(cè)酸性樣品,，應(yīng)該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會(huì)使略帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化,，導(dǎo)致使用一段時(shí)間后對(duì)于某些類(lèi)的分析物保留性質(zhì)有所改變或表現(xiàn)在柱效下降,。建議：用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動(dòng)相洗去多余氨)，之后再進(jìn)行分析這類(lèi)酸性分析物時(shí)建議在流動(dòng)相中略微添加少許氨如0.1％,。

4色譜柱的技術(shù)都有哪些,？比如封尾等，這些技術(shù)在應(yīng)用時(shí)都體現(xiàn)在哪里,？

　　答：色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù),，填料技術(shù)自不待言，填料的好壞對(duì)色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響,。裝柱技術(shù)也沒(méi)有想象中的這么簡(jiǎn)單,，不同固定相、不同粒徑,、不同柱管內(nèi)徑和長(zhǎng)度,，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密,、穩(wěn)定,、均一的柱床，更多是一門(mén)藝術(shù),，需要經(jīng)驗(yàn)積累,。

　　國(guó)內(nèi)和國(guó)外想比，我認(rèn)為色譜柱的差距在于：國(guó)內(nèi)公司以前都不會(huì)自己開(kāi)發(fā)填料,，一般買(mǎi)國(guó)外現(xiàn)成填料裝柱,，買(mǎi)到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里。另外因?yàn)檠b柱歷史短,，經(jīng)驗(yàn)積累少,，裝柱工藝也沒(méi)有*達(dá)到國(guó)外水平。另外,，對(duì)色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料-----裸硅膠,，國(guó)產(chǎn)的還不過(guò)關(guān)，在純度,、粒徑和孔徑的均一性方面和國(guó)外產(chǎn)品相比,，差距很大。

5色譜柱技術(shù)的差距在哪里,？

　　答：液相色譜柱裝填實(shí)際上是有一定技巧和程序,，可能還有一些運(yùn)氣。一般使用高壓勻漿方法裝填,。也就是能讓填料在溶劑內(nèi)均勻地懸浮,。然后用瞬間高壓壓實(shí)，這實(shí)際上用到了不同比例的勻漿液體,，和合適的壓力,。壓力太大，顆粒破碎,，壓力太小,，塔板數(shù)少,。同時(shí)壓力需要穩(wěn)定，不然分布不均,，拖尾嚴(yán)重,。同時(shí)還有頭上平整程度。套上套,，就可以用了,。

6柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢？原來(lái)也討論過(guò)這個(gè)問(wèn)題,，我也拆下來(lái)清洗過(guò),，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮,，然后把清洗好的篩板安裝上去,。問(wèn)題解決了，但使用壽命會(huì)不會(huì)減少呢,？

　　答：柱頭污染了,，就取出污染的，再裝一些填料,。因?yàn)榧尤肽愎瘟诵┨盍?，那么微觀的塔板數(shù)就少了。假入你刮得不多,，僅表面,，可能就是一些臟物，所以,，問(wèn)題解決,。但是今后還會(huì)有同樣問(wèn)題，再掛,，那么不小心刮,，影響柱效。建議還是裝一個(gè)預(yù)柱,。

7如果柱子取下來(lái)放置一段時(shí)間,，需要做什么保護(hù)嗎？

　　答：對(duì)一般的反相柱,，也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中,，然后用堵頭塞緊柱兩頭，以免保存溶劑揮發(fā),，應(yīng)該不需要做特殊的保護(hù),。

8流動(dòng)相中加入適量的四氫（防和諧）呋喃可以改善峰形的機(jī)理是什么？

　　答：《液相色譜方法及應(yīng)用》于世林編著的上面說(shuō)：甲醇為質(zhì)子給予體,、乙腈為質(zhì)子接受體,、四氫（防和諧）呋喃是偶極溶劑,，應(yīng)該除了極性影響，還有另外的影響因素,，至于分離機(jī)理,，還是比較復(fù)雜的，不能看成是個(gè)方法,。

9關(guān)于色譜柱的填裝問(wèn)題。我個(gè)人認(rèn)為現(xiàn)在色譜柱的填裝一般有3種情況：

　　(1)國(guó)外生產(chǎn)填料并填裝完成成品賣(mài)到國(guó)內(nèi),；

　　(2)國(guó)外生產(chǎn)填料,，國(guó)內(nèi)填裝銷(xiāo)售；

　　(3)國(guó)內(nèi)生產(chǎn)填料,，國(guó)內(nèi)填裝銷(xiāo)售,。

　　一般情況下，第1種情況賣(mài)的貴,，但質(zhì)量好,！可是如果是填料的生產(chǎn)很復(fù)雜的話(huà)，那么填裝上國(guó)內(nèi)也跟不上去嗎,？為什么換在國(guó)內(nèi)填裝就會(huì)出現(xiàn)或多或少的一些小問(wèn)題呢,？

　　答：國(guó)內(nèi)填裝會(huì)出現(xiàn)質(zhì)量小問(wèn)題，和國(guó)內(nèi)目前普遍做事沒(méi)有國(guó)外嚴(yán)謹(jǐn)有關(guān)吧,。如果工藝技術(shù)上沒(méi)有問(wèn)題,，又能制訂并切實(shí)執(zhí)行一整套嚴(yán)格的生產(chǎn)質(zhì)量管理措施，國(guó)內(nèi)填裝和國(guó)外填裝并無(wú)區(qū)別,。

10國(guó)產(chǎn)色譜柱在市場(chǎng)上占有比例如何?。?/span>

　　國(guó)內(nèi)色譜柱市場(chǎng)還沒(méi)有人進(jìn)行過(guò)科學(xué)統(tǒng)計(jì),，連一年色譜柱銷(xiāo)售總量也眾說(shuō)紛云,，更別說(shuō)國(guó)內(nèi)生產(chǎn)色譜柱所占份額了。我估計(jì)是占30%左右吧,。

11預(yù)柱或保護(hù)柱用還是不用的問(wèn)題,！原來(lái)分析中藥品種時(shí)，我一直都是用保護(hù)柱,。但來(lái)到新公司后,，發(fā)現(xiàn)大家都沒(méi)有使用，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室連保護(hù)柱都沒(méi)找到一個(gè),，也就是說(shuō)大家從來(lái)都沒(méi)有用過(guò),。后來(lái)問(wèn)一個(gè)老員工，說(shuō)是有可能影響藥品分析,。想問(wèn)：安裝保護(hù)柱后會(huì)影響樣品分析嗎,？我們做的大多是頭孢類(lèi)的抗生素,。

　　答：應(yīng)該這樣說(shuō)，加上保護(hù)柱,，肯定有利于保護(hù)色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞,，肯定有害于分離度和柱效，因?yàn)楸Ｗo(hù)柱中間有著死體積的存在,。但是如果保護(hù)柱接得好,，并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，分離度和柱效應(yīng)該影響并不大,。頭孢類(lèi)的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍,，有些原料藥，可以根據(jù)色譜柱的損耗選擇添加預(yù)柱(中間是個(gè)篩板),，制劑的話(huà),，如果有輔料嚴(yán)重干擾或者流動(dòng)相鹽分比較大，那還是配個(gè)保護(hù)柱比較好,。

12用的是四元梯度泵A50%甲醇B50%水經(jīng)常出現(xiàn)?；蜻M(jìn)氣泡這是什么原因？

　　答：水/甲醇比例在55：45時(shí),，黏度和柱壓有個(gè)極大值,。50：50接近了這個(gè)極值，柱壓是比較高的,，但影響柱壓大的還是填料粒徑和色譜柱內(nèi)徑,，你這個(gè)實(shí)例中不知用的什么規(guī)格的色譜柱？系統(tǒng)壓力高,，可能會(huì)因溶劑泵中的過(guò)濾頭供液速度跟不上而導(dǎo)致氣泡進(jìn)入系統(tǒng),，停機(jī)也應(yīng)該是因?yàn)闅馀葸M(jìn)入壓力下降的原因，可考慮更換液體通量更大的過(guò)濾頭,。

13資料顯示：在正常條件下,，填料粒度＞20µm時(shí)，干法填充制備柱較為合適,；顆粒＜20µm時(shí),，濕法填充較為理想。各種填充方法有什么區(qū)別,？

答：填充方法一般有4種

　?、俑邏簞驖{法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充,；

　?、趶较蚣訅悍ǎ琖aters專(zhuān)（防和諧）利；

　?、圯S向加壓法,，主要用于裝填大直徑柱；

　?、芨煞?。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱,。為什么以20um為分界點(diǎn),？填料方法的前三種都是濕法嗎，能不能對(duì)四種填充方法做一個(gè)簡(jiǎn)短的說(shuō)明,？

14想請(qǐng)您具體說(shuō)明一下反沖色譜柱的方法,，是不連檢測(cè)器嗎？

　　答：反沖就是將柱子反向連到系統(tǒng)中,。因?yàn)橛形廴疚锓礇_出來(lái)，當(dāng)然不連檢測(cè)器,，出液端直接接到廢液瓶就可以,。

15網(wǎng)上對(duì)柱子是否可以反沖一直有爭(zhēng)論，那什么樣的柱子可以反沖,，什么不可以,。反沖后是正者用，還是反著用,。具體到各型號(hào)柱子不僅是ODS柱,，其他如正向柱、氨基柱,、離子交換柱等都有解釋,。

　　答：一般的正相反相柱應(yīng)該都能反沖，只有兩端篩板孔徑不對(duì)稱(chēng)的柱子不能反沖,，不過(guò)目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見(jiàn)了,。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉，反沖后還是正著用比較好,，以免柱子的兩頭都被污染,。我們一直提倡的是：正向使用，反向沖洗,。

16在做方法開(kāi)發(fā)的時(shí)候,用乙腈和水作為流動(dòng)相,在調(diào)整梯度的時(shí)候發(fā)現(xiàn),，剛開(kāi)始用60%乙腈，RT為2.5分鐘,，調(diào)到40%乙腈,，RT沒(méi)有變化，30%也沒(méi)有變化,一直調(diào)到20%的時(shí)候，RT突然變到了約13分鐘,，請(qǐng)問(wèn)這是什么原因,？我用的是離子交換柱。

　　答：離子交換柱的保留時(shí)間主要由洗脫液的離子強(qiáng)度和pH決定,，你現(xiàn)在講的比較簡(jiǎn)單,，需要把你的方法說(shuō)的詳細(xì)一點(diǎn)才能做具體的分析。譬如分析物是什么情況,，其含有極性電離基團(tuán)和非極性基團(tuán)是什么性質(zhì),？離子交換柱是聚合物基質(zhì)還是硅膠基質(zhì)？水相是什么緩沖鹽,？