樣本來源   

對于IHC,，組織是來自患者或動物,，經(jīng)過冷凍或石蠟包埋,。然后切成約4μm厚的切片,。對于ICC,，大部分細胞外基質(zhì)被去除,，只剩下整個細胞來染色,，來源可以是細胞懸液,，或組織培養(yǎng)細胞系,。

然而IHC遠遠不止于把抗體放在組織切片上、然后用顯微鏡觀察那么簡單,。要想得到實用,、可靠而清晰的結果，就需要耐心的對每一步進行優(yōu)化,。根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法和免疫酶法,，R&DSystems的網(wǎng)站列出了IHC/ICC實驗設計和優(yōu)化的變量及影響因素如下：

樣本類型：組織或細胞

樣本制備：組織（石蠟或冰凍），細胞：（貼壁細胞或細胞懸液）

適當對照：無一抗,，組織類型,。

固定方法：灌注或浸泡。

固定劑：甲醛,，醇類,，丙酮。

封閉液：正常血清,，牛血清蛋白（BSA）或脫脂奶粉,。

抗原修復：蛋白酶，加熱。

檢測方法：直接或間接

一抗：物種

二抗：物種

標記物：熒光或酶（顯色）

復染劑：蘇木精或DAPI（熒光）

封片劑：抗淬滅或水性

顯微鏡觀察：熒顯微鏡或光學顯微鏡

處理不同樣本的區(qū)別 

ICC需要透化,，要么通過固定過程,，要么是單獨的透化步驟，而IHC可能不需要單獨的透化步驟,，這取決于切片的厚度和固定方法,。包埋在石蠟中的組織樣本在抗體染色前需要進一步處理。一旦處理好樣品,，IHC和ICC的染色操作就幾乎沒什么差異了,。

樣本固定和制備

組織石蠟包埋前的組織固定：4%甲醛固定劑是組織灌注和浸潤固定的常用溶液，一般需要4–24h,，能很好地保留組織形態(tài),，切片機切片，貼附于載玻片干燥,，石蠟切片存儲室溫多年,，后續(xù)進行IHC/ICC之前需要再水化，需要抗原修復,。

培養(yǎng)細胞固定：2%甲醛室溫固定20min,，細胞樣本貼附載玻片，對于貼壁細胞直接放在6孔或24孔底部的無菌載玻片上生長,，懸浮細胞可通過與包被多聚賴氨酸的載玻片孵育10min而附著在載玻片上,。

冰凍組織切片固定：切片后用醇類固定，用于檢測磷酸化依賴的表位,，在低溫箱進行樣本切片,，冰凍切片存儲–80℃多達一年。通常保留酶的活性和抗原功能,，不需要抗原修復,，冰晶的形成可能負面影響組織結構。