液相色譜柱的使用維護(hù)

一,、液相色譜柱的基本結(jié)構(gòu),。

  液相色譜柱由柱管、壓帽,、卡套（密封環(huán)）,、篩板（濾片）、接頭,、螺絲（封頭）與柱填料等組成,。

柱管：多用不銹鋼制成，若果使用時(shí)柱壓不高于70 kg/cm2時(shí),，也可采用厚壁玻璃或石英管,，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填,。

壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽,，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成,，用于固定篩板,。

密封環(huán)：位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成,，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封,。

    二、色譜柱使用前注意事項(xiàng),。

    色譜柱在使用前,，hao進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考,。在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是jia條件),，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性,。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品,、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同,。

    1,、樣品的前處理

    a、hao使用流動(dòng)相溶解樣品,。

    b,、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。

    c,、使用0.45μm或0.22µm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì),。

    2、流動(dòng)相的配制

    液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

    a,、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中),。

    b,、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)

    c、流動(dòng)相的黏度要盡量小,，以便得到好的分離效果,；降低柱壓降，延長(zhǎng)泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度),。

    d,、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器,，hao使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制,。

    e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低,，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行,。     

    f,、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣,。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè),，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

    3、流動(dòng)相流速的選擇

    因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù),，使用不同的流速可得到不同的柱效,。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求jia柱效,，hao使用jia流速,。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min,，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱,，流速0.8ml／min為佳。

    當(dāng)選用jia流速時(shí),，分析時(shí)間可能延長(zhǎng),。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí),，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量),。

    注意：

    a．含水流動(dòng)相hao在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜,。hao加入die氮化鈉,，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。

    b．流動(dòng)相要求使用0.45 μm或0.22µm濾膜過(guò)濾,，除去微粒雜質(zhì),。

    c．使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,，提高柱性能,。

    三、 色譜柱的使用及維護(hù)

    1,、C18等反相色譜柱使用維護(hù)

   色譜柱每次使用時(shí)一定不要直接使用含無(wú)機(jī)鹽的流動(dòng)相,！

A、建議首先使用含有10～30%乙腈或甲醇的高水相（不含鹽）沖洗系統(tǒng)及色譜柱30min以上（如用水-有機(jī)相（90：10～95:5）,，以0.3～0.6ml/min流速?zèng)_洗30min以上）,，再更換為分析流動(dòng)相。

B,、如果流動(dòng)相中含有緩沖鹽,，請(qǐng)使用過(guò)渡流動(dòng)相過(guò)渡后再換分析流動(dòng)相平衡；

正確使用緩沖鹽,，正確使用緩沖鹽的目的是防止緩沖鹽析出,，使用緩沖鹽的方法可歸結(jié)為一句話：使用前要過(guò)渡，使用后要沖洗,。具體方法如下：

• 等度條件：使用緩沖鹽前用過(guò)渡流動(dòng)相以1.0mL/min 流速?zèng)_洗20-30倍柱體積,，然后再使用含有緩沖鹽的流動(dòng)相,；使用后去除緩沖鹽的方法是用過(guò)渡流動(dòng)相以1.0mL/min 流速?zèng)_洗30倍柱體積，然后以純有機(jī)溶液沖洗30倍柱體積保存,。
• 梯度條件：用含有緩沖鹽的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫之前,，用與初始流動(dòng)相組成相同的過(guò)渡流動(dòng)相以1.0mL/min 流速?zèng)_洗30倍柱體積，再開始梯度的運(yùn)行,；分析完成后,，再用過(guò)渡流動(dòng)相以1.0mL/min 沖洗色譜柱30倍柱體積，然后以純有機(jī)溶液沖洗30倍柱體積保存,。

注意：過(guò)渡流動(dòng)相是指有機(jī)相和水相比例與分析流動(dòng)相相同比例,，只是不含有緩

沖鹽；

阿奇霉素新柱：建議在正常平衡后增加0.1%磷酸/甲醇（90/10）沖洗17小時(shí)

C,、注意事項(xiàng),。

C.1除 AQ外（可耐100%純水），其它反相柱應(yīng)避免使用純水相,，有機(jī)相比例建議在5%以上,。即使AQ也應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間使用100%水沖洗。如果一定要用100%水作為流動(dòng)相,，請(qǐng)?jiān)谒嵝詶l件下使用磷酸鹽緩沖液,，這樣能延長(zhǎng)色譜柱壽命。

C.2請(qǐng)注意色譜柱的pH,、壓力耐受范圍,，如超出范圍或變化幅度較大會(huì)引起重現(xiàn)性變差、色譜柱提前劣化等問題,。

C.3在有機(jī)溶劑含量少,、色譜柱溫度高的條件下，耐酸耐堿性能會(huì)降低,。

C.4使用含有離子對(duì)試劑等表面活性劑的流動(dòng)相,，色譜柱的壽命會(huì)變短。

C.5請(qǐng)使用與分析柱相同填料的預(yù)柱,，否則可能無(wú)法得到正常的色譜峰,。

C.6.在使用了TFA等強(qiáng)有機(jī)酸或堿(pH>8)的流動(dòng)相之后，請(qǐng)使用與所選用的流動(dòng)相組成相同的有機(jī)溶劑和水的混合溶液進(jìn)行置換,。若是一周以上的長(zhǎng)期保存,，請(qǐng)進(jìn)一步使用乙腈進(jìn)行置換，并用附帶的堵頭密封,，保存在冷暗處,。

C.7通常的沖洗可使用高水相-高有機(jī)相-有機(jī)相（乙腈或甲醇）依次沖洗。在甲醇,、乙腈沖洗過(guò)程中,，重復(fù)注入100～200μl四qi呋喃或異丙醇可有助于去除強(qiáng)疏水性物質(zhì)。

C.8當(dāng)供試品溶液中含有一定量表面活性劑,，多次進(jìn)樣后,，由于表面活性劑會(huì)在篩板及硅膠表面形成表面膜，導(dǎo)致峰變寬,、拖尾甚至分叉,。此時(shí)，處理方法如下：將色譜柱反向連接接(詢問廠家),，不接檢測(cè)器,，用水-乙腈（90：10～95:5），以0.6ml/min流速?zèng)_洗2h以上→再用100%乙腈,，以0.6ml/min流速?zèng)_洗1h以上→然后正向連接好色譜柱,，用水-乙腈（90：10～95:5），以1ml/min流速?zèng)_洗1h以上→再用100%乙腈,，以1ml/min流速?zèng)_洗1h以上

2,、SCX 氫型陽(yáng)離子交換柱。

A,、每次使用時(shí)請(qǐng)一定避免直接使用含無(wú)機(jī)鹽的流動(dòng)相,，避免鹽析?？墒褂酶咚噙^(guò)渡后再使用分析流動(dòng)相,。（葡jia胺樣品新柱子，用60%乙腈/40水過(guò)渡半小時(shí)（正常流速即可）,，后再直接用葡jia胺流動(dòng)相平衡即可0.2ml流速平衡過(guò)液,，沖洗也一樣先用60%乙腈40水，低流速?zèng)_半小時(shí),，后轉(zhuǎn)到100乙腈）

B,、離子交換柱的平衡時(shí)間較反相柱更長(zhǎng)，請(qǐng)?jiān)诜治銮氨ＷC充分的平衡,。

C,、.離子交換模式中，洗脫行為一般隨以下幾點(diǎn)發(fā)生大幅變化：

  ①pH ②鹽濃度 ③有機(jī)溶劑量 ④鹽種類

  *為了使樣品充分離子化,，流動(dòng)相pHhao與樣品的pKa相差 2.0以上

D,、短期保存時(shí)，請(qǐng)使用含鹽的水系流動(dòng)相來(lái)保存,；長(zhǎng)期保存時(shí),，請(qǐng)用出廠（或咨詢廠家）流動(dòng)相純乙腈來(lái)保存。注意擰緊柱兩端自帶堵頭,，防止溶劑揮發(fā),。

3,、NH2色譜柱。

A,、每次使用時(shí)請(qǐng)注意避免鹽析,。

B、弱陰離子交換模式中,，一般隨以下幾點(diǎn)洗脫行為發(fā)生大幅變化：

  ①pH ②鹽濃度 ③有機(jī)溶劑量 ④鹽種類

  *為了使樣品充分離子化,，流動(dòng)相pHhao與樣品的pKa相差 2.0以上

C、HILIC模式中,，建議使用乙腈作為有機(jī)溶液,。乙腈量增加，保留能力增大,。

D,、糖類的分析

 ①請(qǐng)?jiān)O(shè)定乙腈/水的流動(dòng)相條件。乙腈的濃度越高,，則對(duì)糖的保留能力越強(qiáng),。

 ②若采用含甲醇或緩沖鹽的流動(dòng)相，峰會(huì)展寬,。

 ③將其他公司硅膠類NH2色譜柱流動(dòng)相條件中的乙腈含量增加5vol%,，使用我公司NH2柱可重現(xiàn)幾乎相同的色譜圖。

 ④若將糖的水溶液作為樣品注入,，譜峰會(huì)展寬,。請(qǐng)使用含乙腈50%以上的溶劑來(lái)配制糖類樣品。

 ⑤曾在酸性條件下使用過(guò)的色譜柱,，糖類分析的保留時(shí)間,、峰形會(huì)發(fā)生變化。

E,、離子型物質(zhì)的分析

 ①請(qǐng)?jiān)O(shè)定乙腈/磷酸緩沖液且具有一定pH值的流動(dòng)相條件,。

 ②考察流動(dòng)相條件時(shí)，按照pH由高到低的順序進(jìn)行考察,。如果曾經(jīng)在低pH下使用,，填料的表面將無(wú)法回到初始狀態(tài)。

 ③有時(shí)需要長(zhǎng)時(shí)間平衡色譜柱(24小時(shí)以上),。平衡所需時(shí)間與通液量和鹽濃度緊密相關(guān),，因此，時(shí)間緊急時(shí)請(qǐng)?zhí)岣吡魉?，或pH不變而增加流動(dòng)相的鹽濃度來(lái)進(jìn)行平衡,。

 ④抗壞血酸的色譜峰有時(shí)會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象(樣品氧化)。  

F,、尿囊素的分析

 尿囊素在pH 2～8范圍內(nèi)未離子化,，請(qǐng)使用磷酸緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行分析,。

流動(dòng)相例：25 mmol/L KH2PO4/ CH3CN = 20 / 80，pH=1.5(H3PO4)

G.一個(gè)月以內(nèi)的保存,，請(qǐng)使用與所選用流動(dòng)相組成相同的有機(jī)溶劑和水的混合溶液（不含酸,、無(wú)機(jī)鹽）進(jìn)行置換,，請(qǐng)避免只用水進(jìn)行置換,；一個(gè)月以上的長(zhǎng)期保存，在進(jìn)行了上述處理之后,，請(qǐng)用出廠時(shí)的溶劑（乙腈）置換并保存 

四,、 色譜柱的再生

    色譜柱經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的使用，會(huì)出現(xiàn)柱壓升高,，柱效下降,，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi),， 使柱頭被污染,；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能是柱頭塌陷,，死體積增大,。您也可嘗試用下面列舉色譜柱再生的方法處理色譜柱。

A,、反相色譜柱的再生：

用以下溶劑至少各30mL沖洗色譜柱(分析柱)

100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈+25%異丙醇→100%異丙醇→100%二氯甲烷→100%己烷→100%異丙醇→75%乙腈+25% 異丙醇→100%乙腈

*若使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱, 則在重新使用反相流動(dòng)相以前, 必須用異丙醇沖洗色譜柱!!!

• 正相色譜柱的再生

一般情況下 ,極性固定相(如 Si , N H2 , Diol 基色譜填料) 的再生可以依次使用 20～30 倍色譜柱體積的正已烷,、異丙醇、二氯甲烷,、甲醇沖洗色譜柱(因異丙醇的粘度較大 ,沖洗過(guò)程中隨時(shí)注意調(diào)整沖洗流速) ,然后再以相反的溶劑順序沖洗色譜柱,。