本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析,。由于酶的催化效率很高,，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,，使測定方法達(dá)到很高的敏感度,。 ELISA可用于測定抗原,，也可用于測定抗體,。

然而,，影響ELISA試驗(yàn)結(jié)果的因素很多,，故加強(qiáng)各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。

ELISA試劑盒的操作方法

雙抗體夾心法

1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml,。在每個板的反應(yīng)孔中加0.1ml,，4℃ 過夜。次日,，棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘,。(簡稱洗滌,，下同)。

2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,，置37℃ 孵育1小時,。然后洗滌。(同時做空白孔,，陰性對照孔及陽性對照孔),。

3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml,。37℃ 孵育0.5~1小時,，洗滌,。

4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10~30分鐘,。

5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml,。

6. 結(jié)果判定:可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽性程度越強(qiáng),，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以"+",、"-"號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上,，于450nm(若以ABTS顯色,，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值,，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,，即為陽性。

間接法

1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,，每孔加0.1ml,，4℃過夜;

2.次日洗滌3次;

3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌;

4.(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml;

5.37℃孵育35-60分鐘,，洗滌;

6.'后一遍用DDW洗滌。

其余步驟同"雙抗體夾心法"的4,、5,、6。

ELISA試劑盒試驗(yàn)的注意事項(xiàng)

1,、要保證移液槍的準(zhǔn)確性,，誤差不能超過2%?？捎盟碗娮犹炱竭M(jìn)行確定,。但需要有專業(yè)人員進(jìn)行矯正。
2,、要配備20ul,、50ul、100ul,、1000ul和排槍各一支,。吸取不同的液體后，要更換槍頭,。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時,。
3、要在實(shí)驗(yàn)前1小時將試劑盒從冰箱中取出,，使各種試劑都恢復(fù)到室溫,，以使結(jié)果更穩(wěn)定。
4,、實(shí)驗(yàn)時,，要使底物避光保存。
5,、用槍吸取液體時速度不能太快,，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。
6,、吸取液體時,，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差,。
7,、將液體加到酶標(biāo)孔中時，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸,，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸,，液滴會自然流下去。
8,、液體全部加完后,，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動30秒，混勻液體,。也可以用酶標(biāo)儀的晃動功能,。
9、溫浴時,，要用不干膠或膠帶紙封好酶標(biāo)板,，防止水分的蒸發(fā)。
10,、洗板時,，每次洗液加入后，應(yīng)靜置1分鐘,，使清洗更加*,。沒有洗板機(jī)時，倒去液體后,，要將酶標(biāo)板在報(bào)紙或毛紙上用力拍干,。
11、洗液不夠時,，可用蒸餾水自行配制PH7.4,，0.02M的磷酸緩沖液,，加入0.1%的吐溫20作為洗液。加入1/1000的疊氮鈉后可長期保存,。
12,、底物是光敏感的，要在臨用前現(xiàn)配,。
13,、檢測前，要打開酶標(biāo)儀,，使之穩(wěn)定10分鐘以上,。
14、底物有一定的毒性,，終止液對皮膚有腐蝕性,，應(yīng)盡量避免接觸。
15,、待檢樣品要澄清,，否則會影響結(jié)果。
16,、溫浴時間應(yīng)遵守試劑盒規(guī)定,。
17、應(yīng)盡量做雙孔實(shí)驗(yàn),，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,。
18、對結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進(jìn)行確證,。