在了解了顯微鏡各主要部件的名稱,、構(gòu)造和功能之后,，為了更好地發(fā)揮顯微鏡的各種功能,，提高工作效率,，保證在顯微觀察及顯微照像過程中取得佳效果,，使用人員必須了解和掌握顯微鏡正確的調(diào)試方法和使用方法,。尤其在新一代顯微鏡中,，具備了多種功能,，能進(jìn)行多種顯微鏡檢方法觀察,，正確的試調(diào)方法和使用方法就顯得尤為重要。下面以研究顯微鏡為例,，簡述調(diào)試及使用方法,。

1. 顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整　

為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明,，在顯微鏡初次安裝和調(diào)試時，就必須把照明光路系統(tǒng)調(diào)整好,，這是正確使用顯微鏡,，并獲得正確、可*結(jié)果的重要手段和基本的要求,。此外,，正確掌握照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，是使用顯微鏡過程中更換光源燈泡后所必經(jīng)的步驟,，也是在日常使用過程中不時地檢驗顯微鏡性能的必要手段,。顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整主要有以下4項內(nèi)容： 

(1) 照明光源燈室在顯微外的初步調(diào)整 

① 首先將燈室的外殼打開，壓彈簧夾子將鹵素?zé)襞菅b入插座中,，安裝時避免手指直接接觸燈泡（可用柔軟的布或紙隔?。悦鉄襞萆狭粲兄讣y等臟物,，影響燈泡的使用壽命,。

② 把燈室擺在桌面上，接通電源后,，用的螺絲刀調(diào)節(jié)燈的調(diào)焦旋鈕孔（標(biāo)有“←→”）,，使燈絲投影在1-2m外的墻上，將燈絲成像調(diào)至清晰,；然后調(diào)節(jié)燈的高低位置調(diào)節(jié)絲孔（標(biāo)有“──”）,，使燈絲位置高低適當(dāng)；再調(diào)節(jié)燈的左右位置調(diào)節(jié)螺絲孔（標(biāo)有“──”）,，使燈絲左右位置合適,。 

(2) 光源發(fā)光體（燈絲）在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗和校正　目的是為了把發(fā)光體的像端端正正地調(diào)入物鏡的視域范圍內(nèi)，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明,，這是調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的前提條件,。需要的基本工具：對中望遠(yuǎn)鏡購置顯微鏡時已配備。 

① 拔掉燈庫內(nèi)的毛玻璃套筒,，把燈室裝回顯微鏡上,；

② 選用10×物鏡，開亮光源程序找樣品并調(diào)焦清晰,，再換用40×物鏡把樣品調(diào)焦清 晰（40×物鏡可以看清燈絲的全貌）,； 

③ 把聚光鏡的孔徑光闌和視場光闌均開到大； 

④ 拔掉其中一個目鏡,，換上對中望遠(yuǎn)鏡,，抓住白色部分，另一手伸縮黑色接目鏡，就可在視野中看到燈絲像,； 

⑤ 如燈絲位置不合適,，調(diào)“──”孔，把燈絲像沿水平方向調(diào)好,，調(diào)“──”孔,，把絲像沿垂直方向調(diào)好，直至將燈絲像調(diào)至剛好充滿物鏡孔徑的光圓像,； 

⑥ 調(diào)整完畢后,，將毛玻璃套筒插回原位，拔掉對中望遠(yuǎn)鏡,，換回目鏡作下一步調(diào)整,。以上所述照明光源燈室在顯微鏡外的調(diào)整和光源發(fā)光體在顯微鏡內(nèi)位置的校驗，只需在顯微鏡初次安裝調(diào)試及更換燈泡時進(jìn)行,，平時使用顯微鏡時不能隨意亂調(diào)亂動,。萬一調(diào)亂時，可按上述步驟調(diào)回原狀,。 

(3) 庫勒照明（Kohler）系統(tǒng)的正確調(diào)整　顯微鏡的正確調(diào)試,，主要工作之一是照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，而其中的關(guān)鍵是庫勒照明系統(tǒng)的調(diào)整,。對于每一位使用顯微鏡的人員,，特別是作顯微照像的人員來說，應(yīng)該對庫勒照明系統(tǒng)的原理及其調(diào)整步驟有一定的了解和掌握,，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的功能,，拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善。庫勒照明系統(tǒng)的原理簡單來說就是：光源發(fā)光體上任意一點發(fā)出的光,，可以照明顯微鏡的視域范圍,，而光源發(fā)光體上每一點所發(fā)出的光匯集起來，在顯微鏡的視域中就實現(xiàn)了非常充分而又均勻的照明,。調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的目的,，是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明，防止雜散光對照像系統(tǒng)造成影響或干擾,，以免照像時在底片形成灰霧,。高調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的必要部件：視場光闌、可進(jìn)行合軸調(diào)整的聚光鏡系統(tǒng),。 

① 選用10×物鏡和10×目鏡,； 

② 把聚光鏡前端透鏡擺進(jìn)光路中，孔徑光闌調(diào)至適中的位置上（不大不?。?，再把聚光鏡升到頂?shù)奈恢蒙希酃忡R轉(zhuǎn)盤調(diào)至明視野“J”位置,； 

③ 把視場光闌調(diào)至?。?.1）； 

④ 載物臺上放上已封片的生物樣品,，開亮光源,，調(diào)焦清晰； 

⑤ 視域中會出現(xiàn)一個局部照明的區(qū)域或亮斑,，這是視場光闌的模糊像,，在其中可以清晰地看到樣品的細(xì)節(jié)；在它之外是較暗的視域,，不一定能把樣品的細(xì)節(jié)看得清楚,；

⑥ 把聚光鏡微微地向下調(diào)，使視野中的亮斑逐漸收小,，慢慢變成一個清晰的多邊形象,，這便是視場光闌的清晰像； 

⑦ 一般情況下,，多邊形象并不在視域中央,，需要調(diào)整聚光鏡的一對調(diào)中螺絲，把視場光闌多邊形的像調(diào)至中央位置,； 

⑧ 逐漸開大視場光闌,，使多邊形象成為視域的內(nèi)接多邊形，進(jìn)一步核對調(diào)中的狀況,，如對中不夠理想,，繼續(xù)微微調(diào)對中螺絲； 

⑨ 將視場光闌稍為再微微開大一些,，使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上,，至此，庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整完畢,。 庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好以后,，整個視域照明均勻，拍攝的顯微照片明亮清晰,，反差正常,。在日后使用過程中應(yīng)特別注意： a. 視場光闌不可任意開大，但可隨物鏡倍數(shù)的增大而將視場光闌收小,，隨物鏡倍數(shù)的減小而開大,； b. 聚光鏡的高低位置不準(zhǔn)亂調(diào)，否則會破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng),； c. 使用10×以下物鏡時要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外,，使用10×或10×以上物鏡時要將前端透鏡擺入光路中,； d. 關(guān)于物鏡倍數(shù)與視場光闌大小配合問題，在實際使用過程中,，作為一般觀察不一定要收小或開大視場光闌,，但作顯微照相時，為了避免雜散光線對照相系統(tǒng)的干擾,，以便能拍攝到較完善的照片,，則應(yīng)在使用每一個倍數(shù)的物鏡時，把視場光闌調(diào)節(jié)到正好消失于所觀察的視域邊上,，這是比較繁復(fù)的工作,，但又非做不可。較為簡便的方法是把與各個倍數(shù)物鏡相對應(yīng)的視場光闌事先調(diào)整好,，并作好記號,，以后使用時根據(jù)記號直接調(diào)至相應(yīng)的位置。 

(4) 孔徑光闌的正確使用　由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率,，使用時應(yīng)掌握正確的使用方法,。過去由于對孔徑光闌的認(rèn)識不足，往往把它當(dāng)作是調(diào)節(jié)視野亮度的工具,。雖然調(diào)節(jié)孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度,，但會直接影響成像的反差、對比度及分辨率,，在使用過程中應(yīng)盡可能避免,。為了發(fā)揮聚光鏡孔徑光闌的作用，以便在觀察時,，尤其在作顯微照相時獲得佳分辨率,，在每換用一個倍數(shù)的物鏡時，在樣品調(diào)焦清晰后,，需要調(diào)節(jié)孔徑光闌,，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑（物鏡孔徑像）的2/3 。 調(diào)整方法是用對中望遠(yuǎn)鏡對焦于視野中黑色相差環(huán)上,，調(diào)節(jié)孔徑光闌,，可以看到一個多邊形的孔徑光闌像，然后調(diào)到等于物鏡孔徑像的2/3,，即介于黑色相差環(huán)外與圓形視域內(nèi)之間,。為方便起見，可把與各倍數(shù)物鏡相對應(yīng)的孔徑光闌預(yù)先調(diào)整好,，并作好標(biāo)記,，以免每次使用都要重新調(diào)整。 

2. 顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及顯微鏡檢術(shù)概要　顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整,，是根據(jù)不同顯微鏡檢術(shù)的需要而進(jìn)行的,。所謂顯微鏡檢術(shù)（microscopy）,，概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法,。以下簡述顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對應(yīng)的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法,。 

(1) 透射光明視野（brightfield）　這是自顯微鏡發(fā)明以來傳統(tǒng)、普遍的應(yīng)用方法,?；静考?a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察,； b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可,，配有孔徑光闌。調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后,，即可應(yīng)用明視野法,。 適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等,。 注意事項： a. 使用明視野方法觀察時,，一定要將庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好； b. 視場光闌不可任意開大,，使用10×,、10×以下和10×以上物鏡時，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實出和擺進(jìn)光路中,； c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調(diào)節(jié)視野的亮度,，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置，否則,，會降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng),； d. 作顯微照相時，每換用一個倍數(shù)的物鏡,，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌,，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 。 

(2) 透射光相差法（phase-contrast）　這是現(xiàn)代顯微鏡檢術(shù)中的一種反差增強法,?；静考合嗖钗镧R、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡,、對中望遠(yuǎn)鏡,、綠色濾光片。 調(diào)整方法： a. 在庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎(chǔ)上,，用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰,； b. 把聚光鏡轉(zhuǎn)到Ph1對準(zhǔn)轉(zhuǎn)盤刻度線位置，選用10×相差物鏡,，換上待觀察的透明樣品,； c. 拔掉其中一個目鏡,，換上對中望遠(yuǎn)鏡，并調(diào)焦于視野中的兩個相差環(huán)上（物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán)）,； d. 視野中的兩個相差環(huán)不一定重合,，調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個調(diào)節(jié)裝置（調(diào)整相差環(huán)左右位置的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉(zhuǎn)鈕），使透光環(huán)作前后左右移動而與黑環(huán)重合,； e. 調(diào)整好后,，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中,，即可觀察到樣品的相差像,； f. 有20×和40×物鏡觀察時，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph2位置上,，用100物鏡時,，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph3位置上。 適用范圍：適用于觀察透明,、未染色或不能染色的樣品,，如各種細(xì)胞、活組織,、未染色或不染色的組織切片,、水生生物等。