農(nóng)藥殘留量測定法

    本方法系用氣相色譜法（通則0521）和質(zhì)譜法（通則 0431）測定藥材,、飲片及制劑中部分農(nóng)藥殘留量,。除另有規(guī)定外,，按下列方法測定,。

    對照品貯備溶液的制備  精密稱取六六六（BHC）（α-BHC,，β-BHC,，γ-BHC,，δ-BHC）,、滴滴涕（DDT） （p,，p'-DDE，p,，p'-DDD,，o，p'-DDT,，p,，p'-DDT）及五氯硝基苯 （PCNB）農(nóng)藥對照品適量，用石油醚（60～90℃）分別制成每1ml約含4～5μg的溶液，即得,。

    混合對照品貯備溶液的制備  精密量取上述各對照品貯備液0.5ml,，置10ml量瓶中，用石油醚（60～90℃）稀釋刻度,，搖勻,，即得。

    混合對照品溶液的制備  精密量取上述混合對照品貯備液,，用石油醚（60～90℃）制成每1L分別含0μg,、1μg、5μg,、 10μg,、50μg、100μg,、250μg的溶液,，即得。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品,，粉碎成粉末（過三號篩）,，取約2g，精密稱定,，置100ml具塞錐形瓶中,，加水20ml浸泡過夜，精密加丙酮40ml,，稱定重量,，超聲處理30分鐘，放冷,，再稱定重量,，用丙酮補足減失的重量，,，稱定重量,，超聲15分鐘，再稱定重量,，用二氯甲烷補足減失的重量,，靜置（使分層），將有機相迅速移入裝有適量無水硫酸鈉的100ml具塞錐形瓶中,，放置4小時,。精密量取35ml，于40℃水浴上減壓濃縮近干,，加少量石油醚（60～90℃）,，用石油醚（60～90℃）溶解 并轉(zhuǎn)移10ml具塞刻度離心管中,，加石油醚（60～90℃）精密稀釋5ml，小心加入硫酸1ml,，振搖1分鐘,，離心（3000 轉(zhuǎn)/分鐘）10分鐘，精密量取上清液2ml,，置具刻度的濃縮瓶 （見圖）中,，連接旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，40℃下（或用氮氣）將溶液濃縮適量,，精密稀釋1ml,，即得。

    制劑  取供試品,，研成細粉（蜜丸切碎,，液體直接量取）,，精密稱取適量（相當于藥材2g）,，以下按上述供試品溶液制備法制備，即得供試品溶液,。

    測定法  分別精密吸取供試品溶液和與之相對應(yīng)濃度的混合對照品溶液各1μl,，注入氣相色譜儀，按外標法計算供試品中9種有機氯農(nóng)藥殘留量,。

    2.22種有機氯類農(nóng)藥殘留量測定法

    色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗  分析柱：以50%苯基50%二甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）,，驗證柱：以100%硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）,，63Ni-ECD電子捕獲檢測器,。進樣口溫度240℃，檢測器溫度300℃,，不分流進樣,，流速為恒壓模式（初始流速為1.3ml/min）。程序升溫：初始70℃,，保持1分鐘,，每分鐘10℃升180℃，保持5分鐘,，再以每分鐘5℃升220℃,，后以每分鐘100℃升280℃，保持8分鐘,。理論板數(shù)按α-BHC計算應(yīng)不低于1×106,，兩個相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。

    對照品貯備溶液的制備  精密稱取表1中農(nóng)藥對照品適量,，用異辛烷分別制成如表1中濃度,，即得,。

    混合對照品貯備溶液的制備  精密量取上述對照品貯備溶液各1ml，置100ml量瓶中,，用異辛烷稀釋刻度,，搖勻，即得,。

    混合對照品溶液的制備  分別精密量取上述混合對照品貯備溶液,，用異辛烷制成每1L分別含10μg、20μg,、50μg,、100μg、200μg,、500μg的溶液,，即得（其中β-六六六、異,、p,，p'-滴滴滴、o,，p'-滴滴涕每1L分別含20μg,、40μg、100μg,、200μg,、400μg、1000μg）,。

    供試品溶液的制備  取供試品,，粉碎成粉末（過三號篩），取約1.5g,，精密稱定,，置于50ml聚苯乙烯具塞離心管中，加入水10ml,，混勻,，放置2小時，精密加入乙腈15ml,，劇烈振搖提取1分鐘,，再加入預(yù)先稱好的無水硫酸鎂4g與氯化鈉1g的混合粉末，再次劇烈振搖1分鐘后,，離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘）1分鐘,。精密吸取上清液10ml，40℃減壓濃縮近干,，用環(huán)己烷-乙酸乙酯（1：1）混合溶液分次轉(zhuǎn)移10ml量瓶中,，加環(huán)己烷-乙酸乙酯（1：1）混合溶液刻度,，搖勻，轉(zhuǎn)移預(yù)先加入1g無水硫酸鈉的離心管中,，振搖,，放置1小時，離心（必要時濾過）,，取上清液5ml過凝膠滲透色譜柱（400mm×25mm,，內(nèi)裝BIO-Beads S-X3填料；以環(huán)己烷-乙酸（1：1）混合溶液為流動相,；流速為每分鐘5.0ml）凈化,，收集18～30分鐘的洗脫液，于40℃水浴減壓濃縮近干,，加少量正己烷替換兩次,，加正己烷1ml使溶解，轉(zhuǎn)移弗羅里硅土固相萃取小柱[1000mg/6ml,，用正己烷-丙酮（95：5）混合溶液10ml和正己烷10ml預(yù)洗]上,，殘渣用正己烷洗滌3次，每次1ml,，洗液轉(zhuǎn)移同一弗羅里硅土固相萃取小柱上,，再用正己烷-丙酮（95：5）混合溶液10ml洗脫，收集全部洗脫液,，置氮吹儀上吹近干,，加異辛烷定容1ml，渦旋使溶解,，即得,。

    測定法  分別精密吸取供試品溶液和混合對照品溶液各1μl，注入氣相色譜儀,，按外標標準曲線法計算供試品中22種有機氯農(nóng)藥殘留量,。

    限度  除另有規(guī)定外，每1kg中藥材或飲片中含總六六六（α-BHC,，β-BHC，γ-BHC,，δ-BHC之和）不得過0.2mg,；總滴滴涕（p，p'-DDE,，p,，p'-DDD，o,，p'-DDT,，p,，p'-DDT之和）不得過0.2mg；五氯硝基苯（Quintozene）不得過0.1mg,；（Hexachlorobenzene）不得過 0.1mg,；七氯（Heptachlor）、順式環(huán)氧七氯（Heptachlor-exo-epoxide）和反式環(huán)氧七氯（Heptachlor-endo-epoxide）之和不得過0.05mg,；（Aldrin）和（Dieldrin）之和不得過0.05mg,；異（Endrin）不得過0.05mg；順式氯丹（cis-Chlordane）,、反式氯丹（trans-Chlordane）和氧化氯丹（oxy-Chlordane）之和不得過0.05mg,； α-硫丹（α-Endosulfan）、β-硫丹（β-Endosulfan）和硫丹硫酸鹽（Endosulfan sulfate）之和不得過3mg,。

    【附注】

    （1）當供試品中有農(nóng)藥檢出時,，可在驗證柱中確認檢出的結(jié)果，再進行定量,。必要時,，可用氣相色譜--質(zhì)譜法進行確證。

    （2）加樣回收率應(yīng)在70%～120%之間,。

    第二法  有機磷類農(nóng)藥殘留量測定法-色譜法

    色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗  以50%苯基50%二甲基聚硅氧烷或（5%苯基）甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）,，氮磷檢測器（NPD）或火焰光度檢測器（FPD）。進樣口溫度220℃,，檢測器溫度300℃,，不分流進樣。程序升溫：初始120℃,，每分鐘10℃升200℃,，每分鐘5℃升240℃，保持2分鐘,，每分鐘20℃升270℃,，保持0.5分鐘。理論板數(shù)按敵敢畏峰計算應(yīng)不低于6000,，兩個相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5,。

    混合對照品貯備溶液的制備  分別精密量取上述各對照品貯備溶液1ml，置20ml棕色量瓶中,，加乙酸稀釋刻度,，搖勻，即得,。

    混合對照品溶液的制備  精密量取上述混合對照品貯備溶液,，用乙酸制成每1ml含0.1μg、0.5μg,、1μg,、2μg,、 5μg的濃度系列，即得,。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品,，粉碎成粉末（過三號篩），取約5g,，精密稱定,，加無水硫酸鈉5g，加入乙酸50～100ml,，冰浴超聲處理3分鐘,，放置，取上層液濾過,，藥渣加入乙酸30～50ml,，冰浴超聲處理2分鐘，放置,，濾過,，合并兩次濾液，用少量乙酸洗滌濾紙及殘渣,，與上述濾液合并,。取濾液于40℃以下減壓濃縮近干，用乙酸轉(zhuǎn)移5ml量瓶中,，并稀釋刻度,；精密吸取上述溶液1ml，置石墨化炭小柱（250mg/3ml用乙酸乙酯5ml預(yù)洗）上,，用正己烷-乙酸（1：1）混合溶液5ml洗脫,，收集洗脫液，置氮吹儀上濃縮近干,，加乙酸定容1ml,，渦旋使溶解，即得,。

    測定法  分別精密吸取供試品溶液和與之相對應(yīng)濃度的混合對照品溶液各1μl,，注入氣相色譜儀，按外標法計算供試品中12種有機磷農(nóng)藥殘留量,。

    第三法  農(nóng)藥殘留量測定法-色譜法

    色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗  為固定液的彈性石英毛細管柱（30m×0.32mm×0.25μm）,，63Ni-ECD電子捕獲檢測器。進樣口溫度270℃,， 檢測器溫度330℃。不分流進樣（或根據(jù)儀器設(shè)置的分流比）,。程序升溫：初始160℃,，保持1分鐘,，每分鐘10℃升278℃，保持0.5分鐘,，每分鐘1℃升290℃,，保持5分鐘。理論板數(shù)按峰計算應(yīng)不低于105,，兩個相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5,。

    對照品貯備溶液的制備  精密稱取、及農(nóng)藥對照品適量,，用石油醚（60～90℃）分別制成每1ml約含20～25μg的溶液,，即得。

    混合對照品貯備溶液的制備  精密量取上述各對照品貯備液1ml,，置10ml量瓶中,，用石油醚（60～90℃）稀釋刻度，搖勻,，即得,。

    混合對照品溶液的制備  精密量取上述混合對照品貯備液，用石油醚（60～90℃）制成每1L分別含0μg,、2μg,、8μg、40μg,、200μg的溶液,，即得。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品,，粉碎成粉末（過三號篩）,，取約1～2g，精密稱定,，置100ml具塞錐形瓶中,，加石油醚（60～90℃）-丙酮（4：1）混合溶液30ml，超聲處理15分鐘,，濾過,，藥渣再重復(fù)上述操作2次后，合并濾液,，濾液用適量無水硫酸鈉脫水后,，于40～45℃減壓濃縮近干，用少量石油醚（60～90℃）反復(fù)操作丙酮除凈,，殘渣用適量石油醚（60～90℃）溶解,，置混合小柱[從上下依次為無水硫酸鈉2g、弗羅里硅土4g、微晶纖維素1g,、氧化鋁1g,、無水硫酸鈉2g，用石油 醚（60～90℃）-（4：1）混合溶液20ml預(yù)洗]上,，用石油醚（60～90℃）-（4：1）混合溶液90ml洗脫,，收集洗脫液，于40～45℃減壓濃縮近干,，再用石油醚 （60～90℃）3～4ml重復(fù)操作除凈,，用石油醚（60～90℃）溶解并轉(zhuǎn)移5ml量瓶中，并稀釋刻度,，搖勻,， 即得。

    測定法  分別精密吸取供試品溶液和與之相對應(yīng)濃度的混合對照品溶液各1μl,，注入氣相色譜儀,，按外標法計算供試品中3種擬。

    第四法 農(nóng)藥多殘留量測定法-質(zhì)譜法

    1.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

    色譜條件  以5%苯基甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm色譜柱）,。進樣口溫度240℃ ,，不分流進樣。載氣為高純氦氣（He）,。進樣口為恒壓模式,，柱前壓力為146kPa。程序升溫：初始溫度70℃,，保持2分鐘,，先以每分鐘25℃升溫150℃，再以每分鐘3℃升溫200℃,，后以每分鐘8℃升溫280℃,，保持10分鐘。

    質(zhì)譜條件  以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測,；離子源為電子轟擊源（EI）,，離子源溫度230℃。碰撞氣為氮氣或氬氣,。質(zhì)譜傳輸接口溫度280℃,。質(zhì)譜監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），各化合物參考保留時間,、監(jiān)測離子對,、碰撞電壓 （CE）與檢出限參考值見表2。為提高檢測靈敏度,，可根據(jù)保留時間分段監(jiān)測各農(nóng)藥,。

    對照品貯備溶液的制備  精密稱取表2與表4中農(nóng)藥對照品適量,，根據(jù)各農(nóng)藥溶解性加乙腈或甲苯分別制成每1ml含1000μg的溶液，即得（可根據(jù)具體農(nóng)藥的靈敏度適當調(diào)整貯備液配制的濃度）,。

    內(nèi)標貯備溶液的制備  取氘代莠去津和氘代對照品適量,，精密稱定,，加乙腈溶解并制成每1ml各含1000μg的混合溶液,，即得。

    混合對照品溶液的制備  精密量取上述各對照品貯備液適量,，用含0.05%醋酸的乙腈分別制成每1L含100μg和 1000μg的兩種溶液,，即得。

    內(nèi)標溶液的制備  精密量取內(nèi)標貯備溶液適量,，加乙腈制成每1ml含6μg的溶液,，即得。

    基質(zhì)混合對照品溶液的制備  取空白基質(zhì)樣品3g,，一式6份,，同供試品溶液的制備方法處理“置氮吹儀上于40℃水浴濃縮約0.4ml”，分別加入混合對照品溶液 （100μg/L）50μl,、 100μl,，混合對照品溶液（1000μg/L）50μl、 100μl,、200μl,、400μl，加乙腈定容1ml,，渦旋混勻,，用微孔濾膜濾過（0.22μm），取續(xù)濾液,，即得系列基質(zhì)混合對照品溶液,。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品，粉碎成粉末（過三號篩）,，取約3g,，精密稱定，置50ml聚苯乙烯具塞離心管中,，加入1%冰醋酸溶液15ml,，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30分鐘,，精密加入乙腈15ml與內(nèi)標溶液100μl,，渦旋使混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5分鐘,，加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4：1）7.5g,，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）3分鐘，于冰浴中冷卻10分鐘,，離心（4000轉(zhuǎn)/min） 5分鐘,，取上清液9ml，置已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管[無水硫酸鎂900mg,，N-丙基乙二胺（PSA）300mg,，十八烷基硅烷鍵合硅膠300mg，硅膠300mg,，石墨化炭黑90mg]中,，渦旋使充分混勻，再置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5分鐘使凈化*,，離心（4000轉(zhuǎn)/min） 5分鐘,，精密吸取上清液5ml，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮約0.4ml,，加乙腈定容1ml,，渦旋混勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過,，取續(xù)濾液,，即得。

    測定法  精密吸取供試品溶液和基質(zhì)混合對照品溶液各 1μl,，注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,，按內(nèi)標標準曲線法計算供試品中74種農(nóng)藥殘留量。

    2.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

    色譜條件  以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（柱長15cm,，內(nèi)徑為3mm,，粒徑為3.5μm）；以0.1%甲酸（含10mmol/L）溶液為流動相A,，以乙腈為流動相B,，下表3進行梯度洗脫；柱溫為35℃,，流速為0.4ml/min,。

    質(zhì)譜條件  以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測；離子源為電噴霧（ESI）離子源,，使用正離子掃描模式,。監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），各化合物參考保留時間,、監(jiān)測離子對,、碰撞電壓（CE）和檢出限參考值見表4。為提高檢測靈敏度,，可根據(jù)保留時間分段監(jiān)測各農(nóng)藥,。

    對照品貯備溶液的制備,、內(nèi)標貯備溶液的制備、混合對照品溶液的制備,、內(nèi)標溶液的制備,、基質(zhì)混合對照品溶液的制備與供試品溶液的制備  均同氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法項下。

    測定法  分別精密吸取氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中的供試品溶液和基質(zhì)混合對照品工作溶液各1～10μl（根據(jù)檢測要求與儀器靈敏度可適當調(diào)整進樣量）,，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,，按內(nèi)標標準曲線法計算供試品中153種農(nóng)藥殘留量。

    【附注】（1）依據(jù)各品種項下規(guī)定的監(jiān)測農(nóng)藥種類并參考相關(guān)農(nóng)藥限度規(guī)定配制對照品溶液,。

    （2）空白基質(zhì)樣品為經(jīng)檢測不含待測農(nóng)藥的同品種樣品,。

    （3）加樣回收率應(yīng)在70%～120%之間。在方法重現(xiàn)性可獲得的情況下,，部分農(nóng)藥回收率可放寬50%～130%。

    （4）進行樣品測定時,，如果檢出色譜峰的保留時間與對照品一致,，并且在扣除背景后的質(zhì)譜圖中，所選擇的監(jiān)測離子對均出現(xiàn),，而且所選擇的監(jiān)測離子對峰面積比與對照品的監(jiān)測離子對峰面積比一致（相對比例>50%,，允許±20%偏差；相對比例>20%～50%,，允許±25%偏差,；相對比例> 10%～20%，允許±30%偏差,；相對比例≤10%,，允許±50%偏差），則可判斷樣品中存在該農(nóng)藥,。如果不能確證,，選用其他監(jiān)測離子對重新進樣確證或選用其他檢測方式的分析儀器進行確證。

    （5）氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定的農(nóng)藥,，推薦選擇氘代作為內(nèi)標,；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定的農(nóng)藥，推薦選擇氘代莠去津作為內(nèi)標,。

    （6）方法提供的監(jiān)測離子對測定條件為推薦條件,，各實驗室可根據(jù)所配置儀器的具體情況作適當調(diào)整；在樣品基質(zhì)有測定干擾的情況下,，可選用其他監(jiān)測離子對,。

    （7）對于特定農(nóng)藥或供試品，分散固相萃取凈化管中凈化材料的比例可作適當調(diào)整,，但須進行方法學(xué)考察以確保結(jié)果準確,。

    （8）在進行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定時,，為進一步優(yōu)化方法效能，供試品溶液終定容的溶劑可由乙腈經(jīng)溶劑替換為甲苯（經(jīng)氮吹近干加入甲苯1ml即可）,。