1,、免疫組化和HE染色的對(duì)比

免疫組化染色和HE染色的不同之處可能是HE染色比較粗略地辨認(rèn)不同細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,；而后者能夠針對(duì)特異性細(xì)胞標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)特異性細(xì)胞的改變（數(shù)量）、也可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)位,，組織中一些特異性蛋白的表達(dá)的量改變（通過(guò)圖像分析系統(tǒng)分析顏色深淺,、分布的面積等綜合分析）。

通俗的講,，HE僅僅是看大體病理改變,，比如組織壞死,，比如炎性滲出。免疫組化,，看你的目的蛋白的表達(dá)情況。

2,、免疫組化DAB顯色

DAB和HE一樣也是一種染色劑,，HE染色相對(duì)簡(jiǎn)單，能分辨出細(xì)胞中的嗜酸嗜堿性物質(zhì),；DAB顯色是經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生化反應(yīng),，DAB是被過(guò)氧化氫在辣根過(guò)氧化物酶催化下產(chǎn)生氧氣所氧化，形成淺棕色不溶性產(chǎn)物,，而定位于過(guò)氧化物酶活性的部位,。

3、什么叫二抗,？

比如羊抗兔（二抗）,，用兔子的免疫球蛋白注射免疫羊，羊就產(chǎn)生可抗兔子免疫球蛋白FC端的抗體,。因此所有羊抗兔可以結(jié)合兔子的同種異型抗體,，也就是說(shuō)只要是兔子產(chǎn)生的抗體，羊抗兔（也叫抗抗體或者2抗）都可與之結(jié)合,。在試驗(yàn)中,，二抗經(jīng)常被打上了標(biāo)記，比如辣根過(guò)氧化物酶,，經(jīng)常被用在ELISA,，WESTERN等經(jīng)典的生物學(xué)試驗(yàn)中。

4,、封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)

封閉的原理：固相載體表面(如elisa板,，NC膜或者PVDF膜上等)有很多洞洞，通過(guò)電轉(zhuǎn)或包被,，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上,，或抗原/抗體固定在板上，蛋白以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附的方式結(jié)合于表面,。蛋白塞進(jìn)了表面的很多洞洞里面,，但蛋白并不是連續(xù)的，有很多空隙,，而且比如說(shuō)樣品孔之間也有空隙,，這些洞洞并沒(méi)有填進(jìn)東西，而抗體也是蛋白,，也會(huì)被吸附在空的洞里,，這樣，就會(huì)有很多非特異性的信號(hào)。封閉液中的蛋白可以與表面上的空白位置結(jié)合,，同樣以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上,，因?yàn)橛?ldquo;填補(bǔ)”和“覆蓋”蛋白結(jié)合位點(diǎn)以避免一抗的非特異結(jié)合，所以有“封閉”的說(shuō)法,。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結(jié)合在空白位置上,。這樣，抗體蛋白就不會(huì)被非特異性的吸附到膜上,，而只會(huì)跟特異性蛋白結(jié)合,。封閉劑應(yīng)封閉所有的未結(jié)合位點(diǎn)而不替換表面上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白表位,、也不與抗體或檢測(cè)試劑有交叉反應(yīng),。

封閉所用試劑：主要為血清，血清封閉原理主要有兩點(diǎn)：是待檢樣本會(huì)有些與蛋白非特異性結(jié)合的物質(zhì),，從而導(dǎo)致背景過(guò)高,，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結(jié)合，從這點(diǎn)看,，BSA和血清沒(méi)有明顯區(qū)別,。第二是待檢樣本中可能會(huì)有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合,，與抗體特異性無(wú)關(guān),，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結(jié)合,。BSA則無(wú)法封閉Fc受體,。

5、免疫組織化學(xué)染色方法

①酶橋法和過(guò)氧化物酶―抗過(guò)氧化物酶復(fù)合物法,。

②親和免疫組織化學(xué)法,。

酶橋法的基本原理是將酶免疫動(dòng)物，制備價(jià)且特異性強(qiáng)的抗酶抗體．然后用第二抗體作為橋,，將抗酶抗體和特異性抗體(即連接在組織抗原上的抗體)連接起來(lái)．再將酶結(jié)合在抗酶抗體上．經(jīng)過(guò)酶催化底物顯色,，從而顯示出抗原所在的部位及含量。

作為橋的第二抗體(即橋抗)必須對(duì)特異性抗體(一抗)和抗酶抗體均有特異性,，這樣才能將兩者相連起來(lái)．因此,，一抗和抗酶抗體應(yīng)由同一種屬動(dòng)物產(chǎn)生。例如,，特異性抗體和抗酶抗體均由兔產(chǎn)生,，再用羊抗兔IgG作為橋抗將兩者連接起來(lái)。

PAP法的基本原理與酶橋法相似,，均是利用橋抗將酶連接在抗體結(jié)合的部位,，所不同的是,，先將酶(過(guò)氧化物酶)和抗酶(過(guò)氧化物酶)抗體(PAP)制成復(fù)合物，以代替酶橋法中的抗酶抗體和隨后結(jié)合的酶,，將兩步合并為一步,。這一重要的改進(jìn)，不僅簡(jiǎn)化了操作步驟,，而且大大提高了敏感性,。PAP法的不足之處是反應(yīng)步驟多，需時(shí)長(zhǎng),，在實(shí)際操作中，會(huì)帶來(lái)非特異性放大效應(yīng),。親和免疫組織化學(xué)結(jié)合了免疫酶組織化學(xué)在待檢抗原部位形成有色沉淀和親和組織化學(xué)能產(chǎn)生有效抗原信號(hào)放大系統(tǒng)的特點(diǎn),，使其敏感性大大增加，操作過(guò)程省時(shí),，背景清晰,。因而成為目前應(yīng)用廣的免疫組織化學(xué)方法。

親和免疫組織化學(xué)法是從酶橋法和PAP法發(fā)展而來(lái),，主要有ABC法和SP法,。

ABC法（卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法），ABC法是利用卵白素與生物素*的高度親和力特性,，與生物素化二抗結(jié)合,，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素-生物素-HRP復(fù)合物，后DAB顯色,。復(fù)合物配制：先將生物素與酶結(jié)合,，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合,，形成卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物,。

SP法（抗生物素蛋白鏈酶素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物），本身沒(méi)有連接生物素,，但有兩個(gè)生物素親和力*的結(jié)合位點(diǎn),，可以與二抗上的生物素結(jié)合，敏感性高,，復(fù)合物不需要使用前混合,，更為簡(jiǎn)便。