檸檬酸合酶（Citrate Synthase,，CS）活性檢測試劑盒

商品貨號：MS1005
英文名稱：Micro Citrate Synthase(CS)Assay Kit
別名：檸檬酸合酶試劑盒 CS Kit 檸檬酸合酶(CS）試劑盒 檸檬酸合酶(CS）測試盒,生化法試劑盒
檢測方法：微量法

測定意義：

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體基質中,，是三羧酸循環(huán)個限速酶,，是三羧酸循環(huán)主要調控位點之一。

測定原理：

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產生檸檬酰輔酶A,，進一步水解產生檸檬酸,；該反應促使無色的DTNB轉變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值,。

貨號：MS1005                                                     規(guī)格：100管/96樣

檸檬酸合酶（citrate synthase,，CS）試劑盒說明書

微量法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：                          

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體基質中,，是三羧酸循環(huán)個限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調控位點之一,。

測定原理：

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產生檸檬酰輔酶A,，進一步水解產生檸檬酸；該反應促使無色的DTNB轉變成黃色的TNB,，在 412nm處有特征吸光值,。

自備實驗用品及儀器：

可見分光光度計/酶標儀,、臺式離心機、水浴鍋,、可調式移液器,、微量石英比色皿/96孔板、研缽,、冰,、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存,；

試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存,；

試劑三：液體1.5mL×1支,，-20℃保存；

試劑四：液體28mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存,；

試劑六：粉劑×1支,，-20℃保存，臨用前加入1.2mL蒸餾水,，用不完的試劑仍-20℃保存,；

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

• 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,，加入1mL試劑一和10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
• 將勻漿600g,，4℃離心5min,。
• 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心10min。
• 上清液即胞漿提取物,，可用于測定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）,。
• 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W,，超聲3秒，間隔10秒,，重復30次）,，用于線粒體CS測定,。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,，調節(jié)波長至412nm,，蒸餾水調零。

2,、樣本測定

（1）在試劑五中加入0.6mL無水乙醇和13mL試劑四,，混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融；

（2）測定管：在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、220μL試劑五和10μL試劑六,，混勻，37℃反應15min后立即測定吸光值A1,。

（3）對照管：在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、220μL試劑四和10μL試劑六，混勻,，37℃反應15min后立即測定吸光值A2,。

（4）計算ΔA=A1-A2，每個測定管設一個對照管,。

CS活性計算：

1. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位,。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位,。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=23.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位,。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.0475×ΔA

V反總：反應體系總體積，2.4×10^-4 L,；ε：TNB摩爾消光系數,，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL；T：反應時間,，2 min,；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL,；W：樣本質量,，g,；500：細胞或細菌總數，500萬,。

1. 使用96孔板測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位,。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=235.3×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位,。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=47.5×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位,。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.095×ΔA

V反總：反應體系總體積，2.4×10^-4 L,；ε：TNB摩爾消光系數,，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應時間,，15 min；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL,；W：樣本質量，g,；500：細胞或細菌總數,，500萬。