檸檬酸合酶（Citrate Synthase,，CS）試劑盒

商品貨號(hào)：QS1005
英文名稱：Citrate Synthase(CS)Assay Kit
別名：檸檬酸合酶試劑盒 CS Kit 檸檬酸合酶(CS）試劑盒 檸檬酸合酶(CS）測(cè)試盒,生化法試劑盒
檢測(cè)方法：常量法

測(cè)定意義：                           

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中,，是三羧酸循環(huán)個(gè)限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一,。

測(cè)定原理：

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶A,，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB,，在 412nm處有特征吸光值,。

貨號(hào)：QS1005-25                                                   規(guī)格：25管/24樣

檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。

測(cè)定意義：                          

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物,、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中,，是三羧酸循環(huán)個(gè)限速酶,，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。

測(cè)定原理：

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸,；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB,，在 412nm處有特征吸光值。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

可見分光光度計(jì),、臺(tái)式離心機(jī),、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、1mL玻璃比色皿,、研缽、冰,、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體25mL×1瓶,，-20℃保存；

試劑二：液體5mL×1瓶,，-20℃保存,；

試劑三：液體0.5mL×1支，-20℃保存,；

試劑四：液體25mL×1瓶，4℃保存,；

試劑五：粉劑×1支,，4℃保存，臨用前加入800μL無水乙醇,，用不完的試劑4℃保存一周,；

試劑六：粉劑×2支，-20℃保存,，臨用前加入400μL蒸餾水,，用不完的試劑仍-20℃保存；

試劑七：粉劑×1支,，-20℃保存,，臨用前加入800μL蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存,；

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

• 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。
• 將勻漿600g，4℃離心5min,。
• 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min,。
• 上清液即胞漿提取物,，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。
• 在步驟④中的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W，超聲3秒,，間隔10秒,，重復(fù)30次），用于線粒體CS測(cè)定,。

測(cè)定步驟：

1,、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、將試劑四,、五,、六和七在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min。

3,、樣本測(cè)定

將上述試劑按順序加入1 mL玻璃比色皿中,，加試劑七的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在412nm波長(zhǎng)下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1和反應(yīng)2min后的吸光值A(chǔ)2,，計(jì)算ΔA=A2-A1,。

CS活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位,。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=222.2×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.4444×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，9×10^-4 L,；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.03 mL,；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬,。