生物技術已經被世界各國視為一種高技術,，在整個科學技術中占據了特殊的顯著地位,，特別是生命科學的發(fā)展更 離不生物技術,，生命科學的發(fā)展備受各國的重視。我國在很多大學中都設立了生命科學院?，F代生物技術一般認 為包括基因工程技術,、細胞工程技術、酶工程技術和發(fā)酵工程技術,，而這些技術的發(fā)展幾乎都與細胞培養(yǎng)有密切 關系,，特別是在醫(yī)藥領域的發(fā)展，細胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價值,。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產過程 中很多是通過細胞培養(yǎng)來實現的,。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO細胞作為載體,；細胞工程中更是離不細胞培養(yǎng)， 雜交瘤單克隆抗體,，*是通過細胞培養(yǎng)來實現的,，既使是現在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開細胞培養(yǎng)。正 在倍受重視的基因治療,、體細胞治療也要經過細胞培養(yǎng)過程才能實現,，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細胞培養(yǎng)密切 相關?？傊?，細胞培養(yǎng)在整個生物技術產業(yè)的發(fā)展中起到了很關鍵的核心作用。細胞培養(yǎng)的發(fā)展,，培養(yǎng)基的質量 又是關鍵,，而培養(yǎng)基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的 應用中牛血清又是為廣泛的,，所以牛血清是醫(yī)藥生物技術產品中重要的原材料之一,。保證牛血清質量也是促進 生物制品質量提高的重要環(huán)節(jié)。 

一,、 牛血清在細胞培養(yǎng)基中的主要功能 

牛血清是細胞培養(yǎng)中用量大的天然培養(yǎng)基,，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能,。  

1.提供對維持細胞指數生長的激素,，基礎培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物,，以及主要的低分子營養(yǎng)物。 

2. 提供結合蛋白,，能識別維生素,、脂類、金屬和其他激素等,，能結合或調變它們所結合的物質活力,。 

3.有些情況下結合蛋白質能與有毒金屬和熱原質結合，起到解毒作用,。 

4.是細胞貼壁,、鋪展在塑料培養(yǎng)基質上所需因子來源。 

5.起酸堿度緩沖液作用,。 

6.提供蛋白酶抑制劑,，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害,。 

二,、 牛血清的主要成份 

血清是一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已為人所知,，但還有一部分尚不清楚,，而且血清組成及含量常 隨供血動物的性別、年齡,、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異,。  

1.蛋白質是牛血清中主要成份。除包括可攜帶金屬離子,、脂肪酸和自身是激素類蛋白外主要還有白蛋白,，球蛋白。 纖維粘連素 細胞促進細胞附著,； α2 巨球蛋白 抑制胰蛋白酶的作用,；胎牛血清中含胎球蛋白 促細胞附著；轉鐵蛋白 能結合鐵離子,，減少其毒性 和被細胞利用,。  

2.多肽：血小板促生長因子能促細胞分裂，是多肽家庭的主要成員之一,，是主要的促細胞增殖因子,；成纖維細胞 生長因子、表皮細胞生長因子,、神經細胞生長因子等,，血清中含量雖很少，但對細胞生長也有一定作用。  

3.激素：激素對細胞的作用是多方面的,。 

胰島素：促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸,，與促細胞分裂有關。 

類胰島素生長因子：能與細胞表達的胰島素受體結合,，從而有胰島素同樣的作用,。 

促生長激素：促細胞增殖效應。 

Hydrocortisone：血清中含有定量的該成分,，它可能兼有促細胞貼附和增殖作用,，但有人證明，血清中的Hydrocortisone ,，如細胞密度高時可能有抑制細胞的作用和誘導其發(fā)生分化,。  

4其他成份 

氨基酸、葡萄糖,、酮酸等對多種營養(yǎng)成分的合成培養(yǎng)基意義不大,。與蛋白相結合狀態(tài)的微量元素對細胞培養(yǎng)有意 義。 

三,、 牛血清的質量要求 

隨著科學技術的發(fā)展和生活水平的不斷提高對生物醫(yī)藥產品的質量要求也越來越高,，所以對制備工藝中所涉及到 的各種原材料的質量標準要求也越來越高，特別是對用于細胞培養(yǎng)基中的主要天然成份――牛血清的質量要求也 不斷提高,。牛血清包括胎牛血清,、新生牛血清和成牛血清。  

（一）,、WHO公布的《用動物細胞體外培養(yǎng)生產生物制品規(guī)程》中的要求：  

1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家,。并應具備適當的監(jiān)測系統(tǒng)。 

2. 有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群,。 

3. 證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。 

4. 血清要通過濾膜過濾除菌,，保證無菌,。 

5. 無細菌、霉菌,、支原體和病毒的污染,，有些國家要求無細菌噬菌體污染。 

6. 對細胞有良好的支持繁殖作用,。 

（二）,、我國在對牛血清的質量2000年版《中國生物制品主要原輔料質控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包 括蛋白質含量,，細菌,、真菌、支原體、牛病毒,、大腸桿菌噬菌體,、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查,。  

（三）,、美國對牛血清的質量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美國牛血清供應商的牛血清都已進入到我國市場，他們對其質量標準要求都極為嚴格,，從血清來源到產品質量都有明確規(guī)定,。  

1） 血清來源：可從世界各國收集胎牛血清，但是必須符合他的質量標準和美國農業(yè)部進口要求,。地方當局還不 清楚本地是否有牛海綿狀病毒流行的血清不收集,，有說明血清質量的證明資料：包括收集過程的全部資料、檢驗 結果和交付情況,。 

2）血清的收集：胎牛血清是心臟穿刺取血,，新生牛（10～14天）和小牛（10個月內）血清靜脈取血。血清采集條 件必須符合工業(yè)生產的標準：低溫下采集,、一次分離,、分離后立即混合凍存。符合要求的血清56℃水浴30分鐘滅 活,。 

3）血清的制備： 

a. 超低IgG胎牛血清：通過親和層析工藝去除胎牛血清中的γ球蛋白,，使FBS γ球蛋白含量減到低，一般IgG≤5ug/ml,，生物學活性不變,。  

b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量＜0.5mg/ml（用葡萄糖氧 化酶／過氧化酶方法測定）。  

c. γ－射線照射：已經證明γ－射線照射可以有效滅活血清中可能污染的病毒,、支原體,。照射劑量為30～45KG。 而且這個劑量的γ－射線照射不會改變血清的理化性質和對細胞培養(yǎng)的影響,。 

4）除菌過濾:經過上述處理的粗制血清再經過一系列除菌濾膜過濾包括0.2微米（micron）和0.1微米濾膜,。FBS要 通過三層0.1微米濾膜，其他血清可通過0.2微米濾膜,。 

4.終產品血清質量 

1）化學檢定：滲透壓 pH 蛋白含量――電泳法 白蛋白 球蛋白 血紅蛋白 隨著牛年齡增加血清中總蛋白含量相應增加,，總的血清蛋白含量可以確定產品規(guī)格和年齡。 

2） 微生物學檢查：細菌,、真菌符合USP標準,。 

支原體：在支原體專業(yè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3～4周，培養(yǎng)溫度36℃±2℃ 分別在需氧和厭氧條件下進行,，有的還需要在支原體瓊脂培養(yǎng)皿上傳4次,，Hoechst熒光素DNA染色檢查那些培養(yǎng)法 無法檢出的支原體如豬鼻支原體等。  

病毒檢查： 

牛蘭舌病毒 Bovin blue tongue 

牛腺病毒 Bovine Adenovirus 

牛細小病毒 Bovine Parvovirus 

牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus 

狂犬病病毒 Rabies 

呼腸弧病毒 Reovirus 

牛呼吸道合胞病毒 BRSV 

副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza 

檢查方法： 

已證明無外源因子污染的牛細胞培養(yǎng)物，在細胞生長液中加15％待測血清,，連傳3代共21天,。陰性對照細胞培養(yǎng)液 中加15％已知無病毒污染的牛血清，與試驗組同條件下進行,。在觀察期內注意細胞形態(tài)變化或細胞病變,。在觀察 期內第14天待檢樣品和對照樣品用標準病毒檢測方法檢查。  如待檢細胞培養(yǎng)物經胰酶消化后分種到6個含蓋玻片的容器內,。陰性對照樣品按同樣方法,。再將牛腹泄病毒、牛細 小病毒,、牛腺病毒,、狂犬病毒和呼腸弧病毒分別加入待檢培養(yǎng)物蓋玻片容器內作為陽性對照，再培養(yǎng)7天,，用熒光 抗體技術進行檢查,。  細胞病變或病毒引起的其他改變通過蘇木精或伊紅染色進行觀察。取另外一個待檢細胞培養(yǎng)瓶用人“O”紅細胞,、 豚鼠紅細胞和新鮮雞紅細胞作血球吸附病毒檢查,。試驗在2～8℃和20～24℃進行。陰性對照細胞預先感染副流感 Ⅲ型病毒作為陽性對照,。未感染的細胞作為陰性對照,。 

3）內毒素檢測 

用鱟試劑檢查。  

4）細菌噬菌體檢查 

主要檢查E.Coli(C300 or K-12)噬菌體,。 

5）激素含量測定 

每批FBS對某些激素含量都要進行測定,，包括：雌二醇、胰島素,、孕硐,、睪丸素、甲狀腺素等,。 

6）血紅蛋白檢測 

血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比≥70％,，血紅蛋白含量≤mg15/dl。 

7）細胞生長效果測定 

a.細胞克隆效果測定 

細胞選擇：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653 

血清濃度與細胞數: 

10％血清／1個細胞／孔 

4％血清／5個細胞／孔 

細胞培養(yǎng)基RPMI－1640,， 96孔培養(yǎng)盤36℃±2℃，5％二氧化碳培養(yǎng)10～ 

15天,。試驗中選擇一個已知參考牛血清作對照,。 

克隆效率計算： 

克隆效率＝(陽性孔平均數/ 培養(yǎng)孔總數) X100％  

相對克隆效率＝待測血清克隆效率/參考血清克隆效率 

b.貼壁效率試驗： 

用人的傳代細胞作每批血清的貼壁效率試驗，A549（人肺癌細胞）該細胞可以反應出低濃度血清的貼壁變化,。采 用6孔培養(yǎng)盤每批血清用兩種濃度和兩種不同的細胞接種數即10％血清――100細胞／孔,，4％血清200介細胞／孔 。放36℃±2℃，濕潤5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14天,，計算著色細胞克隆,，確定貼壁效率。從這兩種不同血清 濃度來確立實驗血清支持細胞貼壁生長的水平,，分析兩種試驗條件下平均貼壁效率,。  

貼壁效率（％）＝(每孔克隆平均數/ 每孔活存的培養(yǎng)細胞平均數) X100％ 

相對貼壁效率＝被測血清貼壁效率/參考血清貼壁效率 

c. 二倍體纖維細胞促生長試驗 

人二倍體細胞株   WI28   MRc5 

25cm2細胞培養(yǎng)瓶，5％血清,，每瓶接種1.5X105細胞連傳3代,，每代血清濃度和接種細胞數相同，每代培養(yǎng)7天,，每 代接種二個細胞瓶,，36℃±2℃培養(yǎng)。以同樣條件用已知參考血清進行平行培養(yǎng),。每代收獲細胞計數,，計算每批待 檢血清與參考血清的相對生長率（RGR）。 

RGR＝(試驗血清每瓶細胞平均數/ 參考血清每瓶細胞平均數) X100％ 

牛血清主要質量要求（Sigma）  

胎牛血清 新生牛血清 成牛血清  

牛齡 胎 10～14天 ＜10個月  

無菌 － － －  

病毒 － － －  

支原體 － － －  

噬菌體 － － －  

內毒素（ng/ml） ≤1.0 ≤10.0 ≤10(15)  

血紅蛋白（g%） 3.0～4.5 3.5～6.0 5.0～8.5  

pH 6.7～8.0 7.0～8.0 7.0～8.0  

滲透壓（mom/Kg H2O） 240～340 240～340 240～340  

新的藥品管理法即將公布,，新的藥品管理法對生物制品提出更嚴格的質量要求,。特別是我國即將加入WTO，會有更 多的國外生物制品進入中國市場,，我國的生物制品也希望更多地走向市場,，所以在制品質量上要求會更高， 產品的市場競爭應主要靠質量競爭,。所以對產品中的主要原材料的質量要求也會越來越嚴格,。如實驗動物我國SDA 已提出嚴格的質量標準，并提出全國各使用部門達到標準的期限,。為了貫徹2000年版《中國生物制品規(guī)程》標委 會修訂了《中國生物制品主要原輔材料質控標準》其中包括了生產用牛血清的質控要求,，這是一個低要求，和國 外產品的要求還有差距,，希望各牛血清生產單位和使用單位,，自己能制定出更高更嚴格的標準，以進一步提高我國生物制品質量,。