盡管ELISA法操作簡(jiǎn)單,，但可能影響測(cè)定結(jié)果的因素也較多。故在實(shí)際操作的過(guò)程中，要加強(qiáng)質(zhì)量管理，認(rèn)真避免或減少影響因素，力求結(jié)果準(zhǔn)確，為疾病的診斷和科研提供可靠的依據(jù)。為確保試驗(yàn)的成功,，進(jìn)口elisa試劑盒操作中要留意以下問(wèn)題：

    加樣：孵育前加樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶試劑加出孔外,，使用滴瓶滴加試劑時(shí),，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，致使滴加的試劑量不準(zhǔn),，都可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確,。控制方法：①實(shí)驗(yàn)樣本過(guò)多時(shí),，可分批次操作,，以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)造成的誤差；②加酶試劑后,，用吸水紙吸干孔外試劑,；③作定量試驗(yàn)時(shí)，使用加樣器加注試劑,，并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性,，此外，要做到一份樣本一個(gè)移液頭,，防止交叉污染,。
    溫育：溫育是ELISA測(cè)定為關(guān)鍵、容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟,。為常見(jiàn)的溫育溫度有37℃和室溫,，其次是43℃和2-8℃。目前國(guó)內(nèi)售ELISA試劑盒溫育時(shí)間為37℃,，30 min-1 h,，進(jìn)口elisa試劑盒則通常為37℃，1-2 h能有較*的結(jié)合,。
    溫育時(shí)間,、溫度的選擇一般根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)選擇溫育的時(shí)間、溫度,。加完樣本和（或）試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時(shí),，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需要一定時(shí)間，如果是將微孔板一放入溫箱即開(kāi)始計(jì)時(shí),，這樣就容易造成實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠,，易致弱陽(yáng)性標(biāo)本測(cè)不出來(lái)?？刂品椒ǎ孩偃缬袃煞N溫度,，盡量使用較低的溫育溫度、較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的條件,；②用1個(gè)小溫度計(jì)放置在板孔反應(yīng)液中測(cè)量觀察,。
    “邊緣效應(yīng)”的排除“邊緣效應(yīng)”是在使用96孔板的ELISA測(cè)定中，外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象,。產(chǎn)生的原因可能是為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的,，因此在溫育時(shí)盡量采用水浴。
    洗板：ELISA測(cè)定的洗板一般有兩種方式,，即手工和洗板機(jī)洗板,。采用手工洗板，孔與孔之間液體易交叉,，采用半自動(dòng)洗板機(jī)時(shí),，洗液量不足導(dǎo)致洗板不*，洗板針堵塞導(dǎo)致抽吸不*,，洗板不暢導(dǎo)致清洗效果差,。控制方法：①手工洗板時(shí),，拍板時(shí)要垂直,，避免交叉污染，用力不能過(guò)猛,，防止抗原抗體復(fù)合物脫離,；②洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時(shí)可用注射器針頭挑出,；③為了洗滌效果好,，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法,，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1-2次，或適當(dāng)增加洗板的次數(shù),，有資料報(bào)道洗板7次能達(dá)到理想的洗滌效果,。
    顯色：市售ELISA試劑盒中，如以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物,，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液,；如以鄰苯二胺(OPD)為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑,。顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15-30 min,。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑，要臨用前30 min配制且必須避光,。以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光,，但A、B液應(yīng)盡量避免接觸金屬器械,。
    結(jié)果判定：讀取結(jié)果要在15-30 min內(nèi)完成,，定性測(cè)定用肉眼判讀試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，反應(yīng)板應(yīng)水平距離白色背景10-15 cm,；定量測(cè)定時(shí)用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果,，酶標(biāo)儀不應(yīng)置于陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，需先預(yù)熱15-30 min再進(jìn)行測(cè)試,。