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反相液相色譜柱是基于溶質(zhì),、極性流動(dòng)相和非極性固定相表面間的疏水效應(yīng)建立的一種色譜模式,，任何一種有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)中都有非極性的疏水部分，這部分越大,，一般保留值越高,，在液相色譜中這是應(yīng)用面較廣的一種分離模式，在生物大分子的反相液相色譜條件下,，流動(dòng)相多采用酸性的,、低離子強(qiáng)度的水溶液，并加一定比例的能與水互溶的異丙醇,、乙腈或甲醇等有機(jī)改性劑,，大量使用的填料為孔徑在30納米以上的硅膠烷基鍵合相，除此之外,，也有少量高聚物微球,。
反相液相色譜柱的使用和維護(hù)
在日常分離分析工作中，反相液相色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要,，色譜柱使用是否得當(dāng),，直接影響色譜柱的壽命，稍有不慎就會(huì)降低柱效,、縮短使用壽命甚至損壞,。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題,，以維護(hù)色譜柱,。
(1)柱子在裝卸、更換時(shí),，動(dòng)作要輕,，接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng),，以免柱床產(chǎn)生空隙,。
(2)如果儀器用來(lái)做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多,，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱，這樣有助于延長(zhǎng)柱子的壽命,。
(3)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng),。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩。
(4)應(yīng)逐
漸改變?nèi)軇┑慕M成,，特別是反相色譜中,，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?/div>
(5)如使用柱溫控制裝置時(shí),，應(yīng)注意在通人流動(dòng)相后才能升溫,。
(6)一般說(shuō)來(lái)反相液相色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì),。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
(7)選擇使用適宜的流動(dòng)相,，以避免固定相被破壞,。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一個(gè)預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí),，預(yù)柱為硅膠,，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解,。
8)避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi),，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個(gè)保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱,。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換,。
(9)經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì),。在進(jìn)行清洗時(shí),，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,，即常規(guī)分析需要50-75mL,。
(10)保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊,，防止溶劑揮發(fā)干燥,。禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
(11)反相液相色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高,，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)人柱內(nèi),，使柱頭被污染,；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,，死體積增大,。
(12)在完成分離分析工作之后，不應(yīng)立即停機(jī),，需及時(shí)對(duì)色譜分析系統(tǒng)進(jìn)行沖洗,，一般0.5h以上，以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì),。
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