實驗原理
脂質(zhì) 體(LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DOPE的混合物(1：1)。它適用于把 DNA 轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,，是目前條件下方面的轉(zhuǎn)染方法之一,。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法,，比它高5-100倍,，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細胞,。
用LR進行轉(zhuǎn)染時,，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細胞適合的用量、作用時間等,，對每批LR都要做,。先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h,，開始,，按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者的劑量,，確定出轉(zhuǎn)染時間,。因LR對細胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時間以不超過24h為宜,。
細胞種類：COS-7,、BHK、NIH-3T3,、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞,。

實驗步驟
1. 操作步驟(方法一)：
   1) 取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2ml含(1-2) x 10 5 個細胞的培養(yǎng)基,，37℃,、18% CO 2 培養(yǎng)基40%-60%匯合時。
   2) 轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染1個空細胞所用的量),。
      A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug,，終量100ul。
      B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR,，使終濃度為2-50ug,，終量100ul。
輕輕混合A液,、B液,，室溫中置10-15min，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象,，但并不妨礙轉(zhuǎn)染,。
   3) 轉(zhuǎn)染準備：用2ml不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1ml不含血清培養(yǎng)基,。
   4) 轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)基中,，搖勻，置37℃溫箱中6-24h,，吸除無血清轉(zhuǎn)染液,，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
   5) 其余處理：如觀察,、篩選,、檢測等與其他轉(zhuǎn)染法相同。
   6) 注意：轉(zhuǎn)染時切勿加血清,，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響,。

2. 快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟(方法二)：
   1) 將細胞以5 x 105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h，使其達到50%-60%板底面積,。
   2) 在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物,。
      a. 在1ml無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。
      b. 旋轉(zhuǎn)1s,，再加入脂質(zhì)體懸液,，旋轉(zhuǎn),。
      c. 室溫下放置5-10min，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上,。
   3) 棄去細胞中的舊液,，用1ml無血清DMEM洗細胞1次后棄去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂質(zhì)體復(fù)合物,，37℃培養(yǎng)3-5天,。
   4) 再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14-24h,。
   5) 吸出DMEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,，2ml/孔，再培養(yǎng)24-48h,。
   6) 用細胞刮或消化法收集細胞,，以備分析鑒定。

3. 穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：
   1) 接種細胞同前述,，細胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染,。
   2) DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細胞同前。
   3) 在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM,，37℃培養(yǎng)48h,。
   4) 吸出DMEM，用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細胞,，使 細胞生長 一定時間,，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行,。
4. Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉(zhuǎn)染單層貼壁細胞,。(別的方法可以參考生產(chǎn)商提供的protocol)
   1) 轉(zhuǎn)染前1天將0.5～2×105細胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含 抗生素 的*培養(yǎng)基,，以保證轉(zhuǎn)染時細胞匯合達90～95％,。

   2) 準備復(fù)合物
      a. 將0.8ug DNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。
      b. 將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中,，輕輕渾勻,，室溫孵育5分。注意：必須在25分內(nèi)進行,。
      c. 5分后將它們混合,，并輕輕渾勻，室溫孵育20分,。
   3) 吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基,，用PBS或無血清培養(yǎng)基清洗細胞2次。
   4) 將復(fù)合物(總體積100ul)加入培養(yǎng)孔，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻,。
   5) 將細胞放入 培養(yǎng)箱 孵育4～6h后,，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復(fù)合物(也可不用)。
   6) 24～48h后可以觀察轉(zhuǎn)入 基因表達 情況,。
   7) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：換含血清培養(yǎng)基24h后將細胞以1：10(或更高比例)傳代,，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選。