本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測定人血清,、血漿,、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK）的含量,。

實驗原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK）水平,。用純化的人磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入人磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK）,，再與HRP標(biāo)記的檢測抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK）含量。

試劑盒組成：

注：標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：2000,、1000,、500、250,、125,、0 pg/mL.

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心,。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心,。

3. 尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。胸腹水,、腦脊液參照實行,。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達到100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用,。

6. 標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）,、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。
3. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外,。
4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘,。
5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用,。
6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。
7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.
8. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
9. 測定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

注意事項：

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果。
3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,，以避免試驗誤差。一次加樣時間zui好控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，zui好做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定,，計算時請后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。
6. 底物請避光保存,。
7. 嚴(yán)格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8. 所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
9. 本試劑不同批號組分不得混用,。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn),。

計算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo)，   

在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD     

值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋      

倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)     

準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值     

代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。                 

（此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。

2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% ,。

檢測范圍：                                              

62.5 pg/mL - 2000 pg/mL

靈敏度：                                              

低檢測濃度小于10 pg/mL

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存： 2-8℃,。

2．有效期： 6個月