實(shí)驗(yàn)?zāi)康模悍蛛x蛋白質(zhì)混合物，將樣品進(jìn)行電泳后,，為了不同目的在它的直角方向再進(jìn)行一次電泳,。常說的雙向電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶的電荷和分子 大小對蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離,。

實(shí)驗(yàn)原理：向等電聚焦的基本原理是利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子的等電點(diǎn)不同，在一個穩(wěn)定的,、連續(xù)的,、線性的pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。第二向運(yùn)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)分子量大小對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,。

基本過程：等電聚焦,、平衡及轉(zhuǎn)移到二向、SDS-Page

試劑或儲液：IPG buffer,、礦物油,、DTT、碘代乙酰胺,、過硫酸銨,、TEMED、1M DTT,、rehydration buffer,、平衡液儲液、30%丙烯酰胺單體儲液,、1.5M Tris-HCl,、10% SDS、10X Tris-甘氨酸系統(tǒng)的電泳緩沖液,、0.5%瓊脂糖,、水飽和正丁醇、占位液

實(shí)驗(yàn)操作程序：

等點(diǎn)聚焦部分

1．根據(jù)選用的膠條的長度計算上樣體積（見附1）,，加1M DTT到終濃度50mM需要的體積,，補(bǔ)加IPG buffer到終濃度0.2%或者0.5%的體積，加rehydration buffer到該膠條的上樣體積,。

2．把各種溶液按計算的體積加入到eppendorf管中,，充分混勻，（或者超聲5-10min）14000rpm,10℃離心5min,。

3．取出膠條室溫放置10min,，平衡膠條的溫度,。

4．沿著聚焦盤中槽的邊緣從左至右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣,，中間的樣品液一定要連貫,。注意：不要產(chǎn)生氣泡，否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布,。

5．當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤中后,，用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。

6．分清膠條的正負(fù)極,，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤中樣品溶液上,，使得膠條的正極（標(biāo)有+，安瑪西亞膠條為）對應(yīng)于聚焦盤的正極（安瑪西亞為）,。確保膠條與電極緊密接觸,。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因?yàn)檫@些溶液不會被膠條吸收,。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡,。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端,，上下移動膠條,，直到氣泡被趕到膠條以外。

7．在每根膠條上覆蓋1-3ml礦物油,，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)析出尿素,。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條,，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上,。

8．對好正、負(fù)極,，蓋上蓋子,。設(shè)置等電聚焦程序（見附2）。

9．聚焦結(jié)束的膠條立即進(jìn)行平衡,、第二向SDS-PAGE電泳,，否則將膠條吸干礦物油置于平衡管中，-80℃冰箱保存,。

注意事項(xiàng)：

參見“雙向電泳培訓(xùn)班講義（定稿）”中等電聚焦注意事項(xiàng)部分,。

附1：

膠條長度、上樣量,、上樣體積,、等點(diǎn)聚焦的伏小時數(shù)的設(shè)置及說明

膠條長度  上樣體積  銀染上樣量范圍 pH3-10L (ug) 推薦使用量（ug）

7cm       125ul      5-100                     50

11cm      185ul     15-200                     100

13cm      250ul     25-250                     125

17cm      300ul     30-300                     150

18cm      350ul     40-400                     200

24cm      450ul     50-500                     250

銀染VHrs    考染上樣量范圍 pH3-10L (mg) 推薦使用量（ug）  考染VHrs

12000       0.05-0.5                    250            22000

20000       0.15-1.2                    500            30000

24000       0.25-1.5                    650            34000

30000       0.25-2.5                    750            40000

36000       0.75-3                      1000           46000 

52000       1-4                         1250           62000 

說明：
1．pH3-10NL, pH4-7, pH6-11的上樣量與pH 3-10相比增加1.5-2倍，聚焦伏小時數(shù)延長約10000VHr
2．按照推薦量上預(yù)實(shí)驗(yàn),，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整上樣量,，樣品中蛋白質(zhì)分布均勻按推薦量使用,，如果有高豐度的蛋白質(zhì)適當(dāng)降低上樣量，如果顯得少則適當(dāng)加大上樣量,。聚焦的伏小時數(shù)可以根據(jù)聚焦的情況進(jìn)行調(diào)整,。