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大鼠抑制素結(jié)合蛋白（INHBP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書
| 本試劑盒僅供研究使用 檢測范圍：0.78 ng/ml - 50 ng/ml zui低檢測限：0.195 ng/ml 特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的大鼠INHBP,，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。 有效期：6個月 預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定大鼠血清,、血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中INHBP含量。 說明 1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。 2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。 3．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。 4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。 實(shí)驗(yàn)原理 用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗INHBP抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗INHBP抗體,、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的INHBP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度,。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。 2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶（凍干品）,。 3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶,。 4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶,。 5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。 6. 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100） 7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100） 8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶,。 9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。 需要而未提供的試劑和器材 1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀 2. 高速離心機(jī) 3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱 4. 干凈的試管和Eppendof管 5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器 6. 蒸餾水,，容量瓶等 標(biāo)本的采集及保存 1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。 2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。 注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。 標(biāo)本的稀釋原則： 首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量,，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù),。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的,。稀釋的過程中,，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時,，稀釋了“N”倍,，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為50 ng/ml,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋50 ng/ml,，25 ng/ml,，12.5 ng/ml,，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml,，1.56 ng/ml,，0.78 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。 如配制25 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。 生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則： 臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl）,，實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl生物素標(biāo)記抗體加990μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則： 臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl）,，實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。 操作步驟 實(shí)驗(yàn)開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時,，均需混勻，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。 1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘,。 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。 2. 棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘,。 3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔,，甩干。 4. 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl,，37℃,，60分鐘。 5. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔，甩干,。 6. 依序每孔加底物溶液90μl,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。 7. 依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液,。 8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。 注： 1. 用戶在初次使用試劑盒時,，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底。 2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。 3. 為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,。 4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體工作液,、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體工作液或,、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。 5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。 洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。 自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。 計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。 注意事項(xiàng) 1. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩,，避免起泡,。 2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。 3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。 4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔。 5. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計(jì)算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。 6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時,，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆,。 7. 底物請避光保存,。 8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。 南京賽泓瑞生物提供支持:http://sorrent.com.cn/st179884 |
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