出現(xiàn)非特異性擴增帶
PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致,，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不*互補,、 或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關,。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增,。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。降低引物量,，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù),。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,，65℃左右退火與延伸)。
 
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差,，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高,，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量,，或調(diào)換另一來源的酶,。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度,。增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)。
 
克隆PCR產(chǎn)物1)克隆PCR產(chǎn)物的優(yōu)條件是什么,？
摩爾數(shù)比1：8或8：1也行,。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,，插入片段共10ul,。室溫保溫1小時,，或4℃過夜。在這2種溫度下,，缺T-凸出端的載體會自連,，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數(shù)克隆要求,，為提高連接效率,，需4℃過夜。
 
2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化,？
如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶,，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶,，可能是積累了大量引物的二聚體,。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆,，而非目的插入片段,。為此需在克隆前做凝膠純化。
 
3)如果沒有回收到目的片段,，還需要作什么對照實驗,？
A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。
如有菌落,，表明氨芐失效,，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落,。
B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒,，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率,。
例如,，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后,，用100ul鋪板,。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落,。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量,。
鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA,，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA,，用1/10鋪板，共用1 ng DNA,。轉(zhuǎn)化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉(zhuǎn)化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞
如沒有菌落或少有菌落,，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率太低,。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物,，產(chǎn)生>20-40藍斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞）,，表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶,。T4 DNA連接酶（M1801，M1804,，M1794）質(zhì)量標準好無核酸酶污染,，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體,，連接pGEM-T正對照,，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的實驗步驟，可得100個菌落,，其中60%應為白斑,，如產(chǎn)生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題,。
 
4)對照實驗結果好,，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題,？
A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆,，為提率,，需4℃過夜。
B）插入片段帶有污染,，使3`-T缺失,，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化,。為此,，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接,。如降低了對照的菌落數(shù),，插入片段需純化，或重新制備,。如產(chǎn)生大量的藍斑,，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失,。
C）插入片段不適于連接,。用凝膠純化的插入片段,，因受UV過度照射，時有發(fā)生,。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體,，不利于連接，DNA必需重新純化,。
D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A,，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A,。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）,。
E）高度重復序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排,，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排,，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

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