出現(xiàn)非特異性擴增帶
PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致,，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不*互補,、 或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數 過多有關,。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn),，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增,。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶,。降低引物量,，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,，65℃左右退火與延伸),。
 
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差,，dNTP濃度過高,，Mg2+濃度過高，退火溫度過低,，循環(huán)次數過多引起,。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶,。②減少dNTP的濃度,。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量,，減少循環(huán)次數,。
 
克隆PCR產物1)克隆PCR產物的優(yōu)條件是什么？
摩爾數比1：8或8：1也行,。應測定比值范圍,。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul,。室溫保溫1小時,，或4℃過夜。在這2種溫度下,，缺T-凸出端的載體會自連,，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求,，為提高連接效率,，需4℃過夜。
 
2)PCR產物是否需要用凝膠純化,？
如凝膠分析擴增產物只有一條帶,，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶,，可能是積累了大量引物的二聚體,。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆,，而非目的插入片段,。為此需在克隆前做凝膠純化。
 
3)如果沒有回收到目的片段,，還需要作什么對照實驗,？
A）涂布未轉化的感受態(tài)細胞,。
如有菌落，表明氨芐失效,，或污染上帶有氨芐抗型的質粒,，或產生氨芐抗型的菌落。
B）轉化完整質粒,，計算菌落生長數,，測定轉化效率。
例如,，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉化,。用SOC稀釋到1000ul后,，用100ul鋪板,。培養(yǎng)過夜，產生1000個菌落,。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量,。
鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA,，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA,，用1/10鋪板，共用1 ng DNA,。轉化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞
如沒有菌落或少有菌落,，感受態(tài)細胞的轉化率太低。
C）如用pGEM-T正對照,，或PCR產物,，產生>20-40藍斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T,?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801,，M1804,，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換,。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體,，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的實驗步驟,，可得100個菌落,，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落,，連接有問題,。
 
4)對照實驗結果好,，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題,？
A）連接用室溫保溫1小時,，能滿足大多數克隆，為提率,，需4℃過夜,。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失,，或抑制連接,，抑制轉化。為此,，將插入片段和pGEM-T正對照混合,，再連接。如降低了對照的菌落數,，插入片段需純化,，或重新制備。如產生大量的藍斑,，插入片段污染有核酸酶,，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適于連接,。用凝膠純化的插入片段,，因受UV過度照射，時有發(fā)生,。UV過度照射會產生嘧啶二聚體,，不利于連接，DNA必需重新純化,。
D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A,，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A,。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）,。
E）高度重復序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產生缺失和重排,，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產生缺失和重排,，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

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