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如何減少ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中背景因素的影響,?

來源:上海哈靈生物科技有限公司   2018年04月24日 11:56  

ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)的原理似乎很簡單,不外乎固定抗原,,添加一抗,、二抗和底物,間中夾雜著

洗滌和封閉,。然而,,即使是平淡無奇的洗滌和封閉,如果做得不太好,,也有可能毀了整個(gè)實(shí)驗(yàn)

,。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),我們是否能獲得有意義的信息,,這在很大程度上取決于結(jié)果的信噪比,。背景

噪音會(huì)影響您對(duì)結(jié)果的判斷。如何降低ELISA的背景,下面有一些tips,。

洗滌很重要

洗滌步驟看似很無聊,,其實(shí)很重要,因?yàn)槿绻唇Y(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測試劑)

殘留在微孔板中,,那么它會(huì)增加背景噪音,。如有必要,可增加洗滌液中的鹽濃度,,這會(huì)阻止非

特異結(jié)合反應(yīng),。如果背景過高,而您懷疑洗滌不夠時(shí),,可以嘗試增加洗滌次數(shù),。

封閉更關(guān)鍵

封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn)。這就降低了可產(chǎn)生信號(hào)的抗體

非特異結(jié)合的機(jī)會(huì),。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧,。如果您的背景過高,懷疑封閉不

充分,,那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液,,或適當(dāng)延長封閉時(shí)間。

如果您一直被背景問題所困擾,,那么也許您該花些時(shí)間來優(yōu)化封閉液,。這可能需要時(shí)間,但也

是值得的,。目前主要有兩種類型的封閉液:蛋白和非離子型去污劑,。您使用的類型須取決于多

個(gè)因素,包括微孔板的表面試劑,、吸附的抗原,、您的抗體和檢測試劑。好的封閉液應(yīng)降低非特

異性結(jié)合,,但它不應(yīng)當(dāng)與抗原,、抗體或檢測試劑發(fā)生相互作用。

常用的非離子型去污劑是Tween-20,。這種封閉液便宜,、穩(wěn)定,在去除洗滌過程中的一些非特

異結(jié)合上很有用,。但它們只在存在時(shí)起作用,,因?yàn)楹苋菀妆幌吹簟R虼怂邢礈煲褐幸脖仨毺?/p>

加封閉液,。請(qǐng)勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%),,它會(huì)降低特異結(jié)合,,產(chǎn)生假陰性。另一

個(gè)選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液,,后者可協(xié)助洗滌過程中的封閉,。

蛋白封閉液則有所不同,是*的,。它們與開放位點(diǎn)結(jié)合并封閉,同時(shí)穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗

原分子,。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA),、脫脂奶粉、正常血清和魚明膠,。血清組

分的內(nèi)在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用,。不過,它的缺點(diǎn)在于能與

Protein A和IgG抗體相互作用,。解決這個(gè)問題的一種方法是使用雞或魚的正常血清,。

抗體濃度須優(yōu)化

我們通常會(huì)follow師兄師姐留下來的操作步驟,但是如果試劑稍有不同,,則可能需要優(yōu)化抗體

的量,。記住,非特異的抗體結(jié)合會(huì)增加背景,。為了防止這一點(diǎn),,切勿使用過多的一抗或二抗。

檢測試劑要適量

另一點(diǎn)也很顯而易見:切勿使用過多的檢測試劑,。如果濃度過高,,或者未正確稀釋,則會(huì)導(dǎo)致

高背景,。也不要顯色過度,,如有必要,優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)加入終止液,。

    如果您的ELISA不幸地遇到了高背景,,那么也無需太擔(dān)心,依次查看ELISA系統(tǒng)中的組分,,

并排除可能存在的問題,。悉心優(yōu)化,相信很快就會(huì)有漂亮的結(jié)果,。

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