所謂real-time Q-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因,，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,，后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在 real-time 技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中,，兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:(1)在90年代早期,，TaqSNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針,，因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能,。(2)此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過(guò)程。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用,。

PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,，終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板,，從而進(jìn)入 平臺(tái)期。在傳統(tǒng)的PCR 中,，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來(lái)檢測(cè)PCR反應(yīng)的終擴(kuò)增產(chǎn)物,，因此用此中點(diǎn)法對(duì)PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real-time Q-PCR中,，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào),，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲 線,。在PCR反應(yīng)早期,，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期,、線性期和終的平臺(tái)期,，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn) 上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并且由此來(lái)推斷模板初的含量,。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較,，在real-time Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號(hào)的域值,，一般這個(gè)域值(threshold)是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào) ,，熒光域值的缺省設(shè)置是3~15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值被認(rèn)為是真正的信號(hào),，它可用于定義 樣本的域值循環(huán)數(shù)(Ct),。Ct值的含義是:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的 對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,，起始拷貝數(shù)越多,，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，因此只要獲得未知樣品的Ct值,，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣 品的起始拷貝數(shù)。