干貨,！腦漿組織如何提取外泌體

外泌體是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外的一種直徑約30 ~ 150 nm的膜性囊泡,。幾乎所有的細(xì)胞都會產(chǎn)生外泌體,，被分泌出的外泌體會進(jìn)入各種體液，通過循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)其他細(xì)胞與組織,，產(chǎn)生遠(yuǎn)程調(diào)控作用,。

         越來越多的研究表明神經(jīng)系統(tǒng)中的生理功能和病理功能與外泌體密切相關(guān)，例如：參與神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元活動,，參與神經(jīng)退行性疾病調(diào)控等,。

    本文中整理了一種可以從腦漿組織中分離和提取外泌體的操作步驟，供大家參考,！

相關(guān)試劑：

1,，Hibernate E Solution （BrainBits, Springfield）

2，木瓜蛋白酶papain（Worthington）

3,，Umibio Exosome Isolation Kit

4,，PBS

相關(guān)設(shè)備：

1，勻漿器

2,，網(wǎng)狀過濾器40-μm

3,，注射器過濾器 0.2μm

4，高速離心機

5,，渦旋振蕩器

操作步驟：

一）腦漿液化處理：

1,，將新鮮或先前冷凍的小鼠半腦切開，加入Hibernate E溶液 (3 mL /半腦),；

2,，加入20單位/ mL的木瓜蛋白酶，在37℃水浴15分鐘,；

3,，加入等體積預(yù)冷Hibernate E后，輕輕勻漿,；勻漿過程中在冰上進(jìn)行,；

4，腦勻漿通過40-μm網(wǎng)狀過濾器過濾,；

5,，濾液再通過0.2-μm過濾器過濾，收集濾液,；

二）液化腦漿預(yù)處理,；

1,，離心去碎片：將液化腦漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，于4℃以3000 g離心10 min,，去除濾液中的碎片,；離心后上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；

2,，離心去雜質(zhì)：轉(zhuǎn)移后的上清液于4℃以10000 g離心20 min,，去除樣品中雜質(zhì)，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,；

三）腦漿外泌體的提?。?/span>

通過Umibio Exosome Isolation Kit提取外泌體顆粒,。

1,，上清液預(yù)處理：在去除雜質(zhì)的離心上清液中加入Exosomoe Concentration Solution（ECS試劑），具體的加入劑量如下：

注：其他劑量規(guī)格請根據(jù)表中的試劑用量等比例換算

2,，溶液混合：加入ECS試劑后將離心管蓋緊,，通過渦旋振蕩器混勻1 min，再放置于2℃至8℃靜置2 h,；

3,，沉淀外泌體：取出裝有混合液的離心管于4℃以10000 g離心60 min，棄上清,，沉淀中富含外泌體顆粒,；（注：盡可能吸凈上清液）

4，外泌體重懸：取100μL 1×PBS均勻吹打離心沉淀物,，待其均勻懸浮在PBS中后,，將重懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中,；

5,，收獲外泌體顆粒：將含有重懸液的1.5 mL離心管于4℃以12000 g離心2 min，保留上清液,，該上清液中富含外泌體顆粒,。（注：若離心沉淀物肉眼可見，再離心一次）

6,， 純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉(zhuǎn)入Exosomoe Purafication Filter（EPF柱）上室中,，于4℃以3000 g離心10 min，離心后收集EPF柱管底的液體,，此液體即為純化后的外泌體顆粒,；

7，外泌體的保存：純化后的外泌體以保存于-80℃低溫冰箱中,，以備后繼實驗使用,。

參考文獻(xiàn)：

         1,， J Biol Chem. 2012 Dec 14;287(51):43108-15.

    2，J Extracell Vesicles. 2017 Jul 26;6(1):1348885.