fff簡(jiǎn)介分子之間的能量轉(zhuǎn)移大多是由輻射導(dǎo)致的。然而當(dāng)不同熒光物質(zhì)非?？拷鼤r(shí)（<10nm），會(huì)發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移（RET）。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是一種的型的 RET現(xiàn)象,。

圖1 所示在 FRET 中，使用強(qiáng)光照射以激發(fā)供體能量,，處于激發(fā)態(tài)的供體將一部分或全部能量轉(zhuǎn)移給

受體,，受體被激發(fā)。如果受體熒光量子產(chǎn)率為零,，則發(fā)生能量轉(zhuǎn)移熒光熄滅,；如果受體也是一種熒光發(fā)射

體，則呈現(xiàn)出受體的熒光,。光照下很多熒光物質(zhì)會(huì)逐漸失去其熒光特性,，這種現(xiàn)象被稱為光漂白。為了提高靈敏度,，近期生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）得到了廣泛應(yīng)用¹,。BRET使用生物發(fā)光物質(zhì)代替了熒光供體。由于BRET不在需要直射光線以激發(fā)供體,，不存在放射性的能量轉(zhuǎn)移,，所以避免了對(duì)樣品的損害（如圖2）。熒光素酶是一種螢火蟲體內(nèi)的生物發(fā)光酶,，被廣泛用于 BRET研究²,。本實(shí)驗(yàn)中，選擇Luc8（海腎熒光

素酶）作為供體（圖3）,，該物質(zhì)由海腎（Renillareinformis）基因突變而來,。如圖4所示，Luc8 的生物

熒光峰值接近480nm,。

圖2：BRET示意圖

圖 3：海腎（左）和Luc8蛋白結(jié)構(gòu)（右）

圖 4：Luc8的發(fā)射光譜右）

本實(shí)驗(yàn)中,，使用了四種類型的量子點(diǎn)（605、655,、705和800）：它們具有高量子產(chǎn)率,，并適用于多種熒光波長(zhǎng)（圖5）,。這些量子點(diǎn)在較大的波長(zhǎng)范圍內(nèi)都有吸收，但是在605,、655,、705和800nm時(shí)發(fā)出的熒光較強(qiáng)。

圖 5：量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)（左）和熒光（右）

發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)于強(qiáng)光直射產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較弱,，同時(shí)使用微量比色皿獲得的光量較小,。為了在測(cè)量 BRET時(shí)能夠更加地收集光，本實(shí)驗(yàn)使用了發(fā)光微量池支架,，該配件可zui大程度減少微量池與發(fā)射透鏡之間的距離（圖6）,。

試劑和儀器

1.Lumina熒光分光光度計(jì)

2.發(fā)光微量池支架

3.PBS緩沖液0.1M（pH 7.4）

 4.Luc8 150 M

5.量子點(diǎn)605、655,、705,、800 8 M（Invitrogen）

6.腔腸素H 1 g/ l 甲醇溶液（Promega）

7.NiCl2 100 M 蒸餾水溶液（Sigma Aldrich）

8.10 l 微量離心管 

9.45 l 熒光微量池

10.吸液管和吸液頭

11.渦旋混合器

實(shí)驗(yàn)步驟

1.準(zhǔn)備4個(gè)10 l 微量離心管。

2.在每個(gè)離心管內(nèi)填充94 l PBS 緩沖液和 1 l Luc8（供體）,。

3.在每個(gè)離心管中添加5 l量子點(diǎn)605,、655、705,、800（受體）,。

4.在每個(gè)離心管中注入2 l NiCl₂溶液（供體和受體之間的結(jié)合試劑），并在充分混合,。

5.將發(fā)光微量池支架安裝到Lumina上,，注入樣品并插到支架上。

6.打開Luminous WaveScan 軟件,，輸入設(shè)定參數(shù),，點(diǎn)51擊應(yīng)用（Apply）（圖7）。

7.使用吸液管注入2 l腔腸素H,，迅速合攏測(cè)試艙蓋,，點(diǎn)擊開始按鈕。

8.應(yīng)用基線校正功能對(duì)測(cè)得的光譜進(jìn)行校正,。單擊基線校正（Baseline Correction）圖標(biāo),，使用具有zui低生物發(fā)光強(qiáng)度的波長(zhǎng)進(jìn)行基線校正（圖8）。

9.根據(jù)Luc8峰值對(duì)光譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正,，比較量子點(diǎn)峰值,。為了標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算各個(gè)轉(zhuǎn)換標(biāo)量,，使得所有Luc8峰值強(qiáng)度相等,。然后單擊標(biāo)量計(jì)算器（Scalar Calculator）圖標(biāo)，通過乘以轉(zhuǎn)換標(biāo)量對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換（圖9）,。

儀器參數(shù)

圖 7：波長(zhǎng)掃描測(cè)量條件

圖 8：基線校正窗口

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從測(cè)得的光譜上,，可以觀察到BRET現(xiàn)象,，Luc8與各量子點(diǎn)發(fā)生了生物發(fā)光能量轉(zhuǎn)移（圖10）。由于多重量子點(diǎn)結(jié)合可在單個(gè)波長(zhǎng)條件下產(chǎn)生多種波長(zhǎng),，因此使用量子點(diǎn)的BRET對(duì)分子診斷和成像領(lǐng)域均有很大助,。BRET 能量轉(zhuǎn)移的效率的因素有：（1）供體和受體之間的間隔距離；（2）供體發(fā)射和受體激發(fā)光譜的重疊,。通過比較使用Luc8峰值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正的光譜，我們可以證實(shí)量子點(diǎn)665-Luc8結(jié)合物在多個(gè)結(jié)合物中產(chǎn)生的BRET效率zui高,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

Thermo Fisher公司的Lumina熒光分光光度計(jì)和發(fā)光微量池架配件有助于檢查BRET,，其產(chǎn)生的噪音要小于FRET。此外,，實(shí)驗(yàn)證明根據(jù)量子點(diǎn)發(fā)射波長(zhǎng)的不同,，BRET現(xiàn)象可應(yīng)用于較廣的波長(zhǎng)范圍。