簡介

在生物化學領域中,，生物材料的熱學性能研究是材料分析的重要組成部分,。而熔解溫度（T_M）是生物材料中應用zui廣泛的熱學性能。生物材料由許多化學鍵組成,，隨著溫度的升高，材料內能增加同時化學鍵斷裂,。這種因化學鍵斷裂而導致生物材料結構改變的現(xiàn)象被稱作熱變性,。此外，zui活躍時的變性溫度被稱為熔解溫度,。熔解溫度是用于表征材料穩(wěn)定性的指標之一,。寡核苷酸是一種遺傳物質，由多組堿基構成,。寡核苷酸可以很容易地和它們的互補對鏈接,，所以常用來作為探針確定DNA或RNA的結構，經常用于基因芯片,、電泳,、熒光雜交等過程中。如圖1所示,，我們將Alexa Fluor^® 488 熒光探針標記在寡核苷酸的5´  端部,，將Alexa Fluor^® 532 熒光探針連接在另一端。

本實驗采用Thermo Fisher公司的lumina熒光分光光度計配備 Peltier 溫控系統(tǒng)（圖2）對不同溫度下的熒光性能進行了測量,。Peltier溫控系統(tǒng)可快速地對溫度進行調節(jié),，溫度范圍可控制在-10℃到100℃。該系統(tǒng)有樣品除霜功能,、磁力攪拌功能和溫控功能,。本研究采用 Lumina 和 Peltier系統(tǒng)，結合熒光標記,，研究了寡核苷酸熒光強度與溫度的關系,。zui終根據一階導數(shù)分析熔點曲線并計算出了T_M 值。

圖 2：Peltier 系統(tǒng)配件（單池池架（a）,、4 聯(lián)池池架（b）,、Peltier 控制模塊（c））

試劑和儀器

1.Lumina熒光分光光度計 

2.Peltier 控制模塊、單池池架

3.供體寡核苷酸5´  – (Alexa 488) – ACCGTGAGCA – 3´

4.受體寡核苷酸

5´ – (Alexa 532) – TGCTCACGGT – 3´ 5.Tris-EDTA 緩沖液（pH 8.0）

6.NaCl（ACS 試劑,，≥99.0%）

7.10ml 塑料管

8.熒光比色皿

實驗步驟

1.添加 10ml 的 Tris-EDTA 緩沖液（pH 8.0）到兩根塑料管中,，形成濃度分別為172mM（供體）190mM（受體）的NaCl溶液,。

2.在上述緩沖液中溶解供體/受體寡核苷酸，使?jié)舛茸?/span>為900nM,。

3.混合已制備的供體試劑和受體試劑,，然后在室溫下培養(yǎng)5分鐘。

4.將Peltier系統(tǒng)安裝在 Lumina上,。5.打開Luminous的Thermal軟件,，如圖3輸入預定參數(shù)。使用軟件（Excel^®, Origin^®等）根據供體各測量點數(shù)據計算一階導數(shù),，并在測量后查看T_M 值,。

儀器參數(shù)

圖3：Thermal軟件測量條件

實驗結果

FRET 現(xiàn)象是供體到受體的一種能量轉移現(xiàn)象，這是由于熒光物質受熱前熒光探針間距離較短造成的,。因

此,，在供體激發(fā)波長519nm處發(fā)出較弱的熒光，在受體的激發(fā)波長553nm處發(fā)出較強的熒光,。另一方面,，

隨著受熱產生的熱變性現(xiàn)象，與FRET現(xiàn)象相反,。換句話說，熒光在519nm時較強,，而在553nm時較弱（圖4）,。

圖4：受熱前（左圖，25℃）,、受熱后（右圖,，55℃）熱變性熒光強度如圖5所示，我們繪制了供體,、受體熒光強度與溫度的關系,。可以確認,，供體和受體上發(fā)生的熒光強度逆轉的情況是由于 FRET 現(xiàn)象消失導致的,。

圖5：供體、受體熒光強度與溫度的關系

目前有多種方法可以確定T_M 值,，本實驗中我們通過一階導數(shù)的峰值來確定T_M 值,。本次試驗所用寡核苷酸的TM 值為49℃。（圖6）

圖6：熒光強度隨溫度而改變

實驗結論

本研究中,，使用Thermo Fisher公司Lumina熒光分光光度計和Peltier 溫控系統(tǒng),，研究了溫度變化對寡核苷酸熒光強度的影響。此外,，根據實驗數(shù)據計算出代表材料安全性的TM 值,。