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ELISA實驗的基本操作流程1. 包被ELISA板子或使用商品化ELISA板,。 2. 加待檢樣品:使之與固相抗體/抗原反應(yīng)一段時問,,讓標(biāo)本中的抗原/抗體與固相載體上的抗體/抗原結(jié)合,,形成固相復(fù)合物。 3. 加酶標(biāo)抗體:使固相復(fù)合物與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。 4. 加底物:夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行抗原/抗體的定性或定量。
用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,,4℃過夜,。次日,棄去孔內(nèi)溶液,,用洗滌緩沖液洗3次,,每次3分鐘。(簡稱洗滌,,下同),。 2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,。然后洗滌,。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔),。 3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小時,,洗滌,。 4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘,。 5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml,。 6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,,陽性程度越強,,陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,,以"+",、"-"號表示。也可測O·D值:在ELISA檢測儀上,,于450nm(若以ABTS顯色,,則410nm)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,,即為陽性。
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