miRNA主要通過與靶mRNA的結(jié)合,，或促使mRNA降解，或阻礙其翻譯,，從而抑制目的基因的表達(dá),。用生物信息學(xué)方法準(zhǔn)確快速地預(yù)測miRNA的靶基因,，可以為研究miRNA功能提供線索。 

下面總結(jié)一些熒光素酶實驗中常見的問題,。  

1轉(zhuǎn)染成功如何判斷,？ 
 

共轉(zhuǎn)染的幾個質(zhì)粒中，3' UTR質(zhì)粒及Renilla質(zhì)?？赏ㄟ^zui終的luc讀值判斷是否轉(zhuǎn)染成功,，而miRNA質(zhì)粒或mimic的轉(zhuǎn)染情況無法從zui終的luc讀值做出判斷,，因而針對miRNA,，轉(zhuǎn)染是否成功可用以下方法進(jìn)行： 
i.如轉(zhuǎn)入的miRNA帶熒光標(biāo)記如GFP，則可直接在轉(zhuǎn)染后,、細(xì)胞裂解前,，顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光,； 
ii.如轉(zhuǎn)入的miRNA不帶任何熒光標(biāo)記,，可考慮進(jìn)行miRNA的qRT-PCR檢測，通過檢測結(jié)果判斷實驗組2,、4,、6是否相對其對照組miRNA有顯著過表達(dá)。 
iii.設(shè)置一個熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參照組,，同批轉(zhuǎn)染一個組的細(xì)胞,，間接反映出同批次實驗的轉(zhuǎn)染情況。  
 

2如何判斷實驗體系無異常，獲得客觀的實驗結(jié)果,？ 可以從以下幾個方面來考察實驗結(jié)果的客觀性： 

對照的2個實驗組,，即實驗組1與實驗組2 luc表達(dá)情況應(yīng)無顯著差異； 轉(zhuǎn)染正常,，質(zhì)?；騧imic確保成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞； luc檢測值在儀器檢測線性范圍內(nèi),。  
 

3 陰性結(jié)果如何理解,？ 

在確保實驗體系無異常的前提下，如果zui終檢測到的結(jié)果是陰性結(jié)果,，則基本可以判斷目的miRNA不能直接調(diào)控靶基因的表達(dá),，不死心的話就再做一次，如果仍然是陰性結(jié)果,，死心吧,。 
有的同學(xué)說我一次做出陽性結(jié)果一次做出陰性結(jié)果咋辦？那就恭喜你再重復(fù)吧,，結(jié)果一直波動的話可能是實驗系統(tǒng)或其他原因,，  
 

4為何與文獻(xiàn)報導(dǎo)有差異？ 

實驗中,，我們往往會遇到無法重復(fù)出文獻(xiàn)中結(jié)果的問題,，這是肯定的，不同實驗室實驗條件,、實驗材料,、實驗細(xì)節(jié)并不能確保與文獻(xiàn)*一致所致。因此,，只要我們相信自己就行,。  
 

5實驗體系是否可以優(yōu)化？如何優(yōu)化,？

該實驗的關(guān)鍵點在細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率,，轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化可通過調(diào)整共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的比例或調(diào)整轉(zhuǎn)染體系來進(jìn)行，設(shè)置合理的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量梯度,，觀察microRNA對靶基因的抑制是否存在劑量效應(yīng)或是否存在變化趨勢的一致性,，從而使結(jié)論更加可靠。  
 

6使用mimics的一些問題,？ 

有的同學(xué)喜歡使用mimics來做實驗,，其實mimics就是體外合成的成熟體miRNA，同樣可以反轉(zhuǎn)錄,，用qRT-PCR來檢測表達(dá)量,，但是大家應(yīng)該很少看到有文章把mimics的過表達(dá)量PCR結(jié)果放出來的吧,，那是因為mimics的過表達(dá)通常在數(shù)萬到數(shù)十萬倍，miIRNA通常會靶向結(jié)合許多靶基因,，這么強(qiáng)的外源過表達(dá)肯定會引起嚴(yán)重的脫靶效應(yīng),，給審稿人把柄質(zhì)疑你嗎？對于這種找抽的行為大家肯定是積極規(guī)避的,。質(zhì)粒介導(dǎo)的miRNA過表達(dá)由于是模擬了前體在生物體內(nèi)的剪切,，其過表達(dá)通常在數(shù)十倍到數(shù)百倍，可能引起的脫靶效應(yīng)遠(yuǎn)沒有mimics嚴(yán)重,。 
 
7是否還有其他方法驗證miRNA對靶基因表達(dá)的調(diào)控,？ 

驗證miRNA對靶基因的調(diào)控，也可直接檢測miRNA過表達(dá)或下調(diào)表達(dá)后,，靶基因在mRNA（qRT-PCR方法）或蛋白水平上的變化（Western Blot方法）,。