1 斜面低溫保藏法

將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上,，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好,，移至 2—8℃的冰箱中保藏,。

保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌,、放線菌及有芽孢的細菌保存 2—4 個月,，移種一次。酵母菌兩個月,，細菌每月移種一次,。

2 液體石蠟保藏法

1. 將液體石蠟分裝于三角燒瓶內，塞上棉塞,，并用牛皮紙包扎,，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌 30 分鐘,，然后放在 40℃溫箱中,，使水汽蒸發(fā)掉，備用,。
2. 將需要保藏的菌種,，在zui適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子,。
3. 用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟,，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端 1cm 為準,，使菌種與空氣隔絕。
4. 將試管直立,，置低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長),。

3 濾紙保藏法

1. 將濾紙剪成 0.5×1.2cm 的小條，裝入 0.6×8cm 的安瓿管中,，每管 1—2 張,，塞以棉塞，1.05kg/cm2>,，121.3℃滅菌 30 分鐘,。
2. 將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),，使充分生長,。
3. 取滅菌脫脂牛乳 1—2ml 滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內，取數環(huán)菌苔在牛乳內混勻，制成濃懸液,。
4. 用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內,，使其吸飽，再放回至安瓿管中,，塞上棉塞,。
5. 將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干,。
6. 將棉花塞入管內,，用火焰按圖Ⅶ-13 熔封，保存于低溫下,。
7. 需要使用菌種,，復活培養(yǎng)時，可將安瓿管口在火焰上燒熱,，滴一滴冷水在燒熱的部位,，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃,，待安瓿管開啟后,，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內,，置溫箱中培養(yǎng),。

4 沙土保藏法

1. 取河沙加入 10%稀鹽酸，加熱煮沸 30 分鐘,，以去除其中的有機質,。
2. 倒去酸水，用自來水沖洗至中性,。
3. 烘干,，用 40 目篩子過篩，以去掉粗顆粒,，備用,。
4. 另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數次,，直至中性,。
5. 烘干，碾碎,，通過 100 目篩子過篩,，以去除粗顆粒。
6. 按一份黃土,、三份沙的比例(或根據需要而用其他比例,，甚至可全部用沙或全部用土)摻合均勻,，裝入 10×100mm 的小試管或安瓿管中，每管裝 1g 左右,，塞上棉塞,，進行滅菌，烘干,。
7. 抽樣進行無菌檢查,，每 10 支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中,，37℃培養(yǎng) 48 小時,，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌,，再作無菌試驗,，直至證明無菌，方可備用,。
8. 選擇培養(yǎng)成熟的(一般指孢子層生長豐滿的,，營養(yǎng)細胞用此法效果不好)優(yōu)良菌種，以無菌水洗下,，制成孢子懸液,。
9. 于每支沙土管中加入約 0.5ml(一般以剛剛使沙土潤濕為宜)孢子懸液，以接種針拌勻,。
10. 放入真空干燥器內,，用真空泵抽干水分，抽干時間越短越好,，務使在 12 小時內抽干,。
11. 每 10 支抽取一支，用接種環(huán)取出少數沙粒,，接種于斜面培養(yǎng)基上,，進行培養(yǎng)，觀察生長情況和有無雜菌生長,，如出現雜菌或菌落數很少或根本不長,，則說明制作的沙土管有問題，尚須進一步抽樣檢查,。
12. 若經檢查沒有問題，用火焰熔封管口,，放冰箱或室內干燥處保存,。每半年檢查一次活力和雜菌情況。
13. 需要使用菌種,，復活培養(yǎng)時,，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內,，置溫箱中培養(yǎng)。

5 液氮冷凍保藏法

1. 準備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管,，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂,，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管,，安瓿管的大小通常使用 75×10mm 的,，或能容 1.2mm 液體的。
2. 加保護劑與滅菌保存細菌,、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細胞時,，則將空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2,，121.3℃滅菌 15 分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內預先加入保護劑如 10%的甘油蒸餾水溶液或 10%二甲亞砜蒸餾水溶液,，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1.05kg/cm2>,，121.3℃滅菌 15 分鐘,。
3. 接入菌種將菌種用 10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管;霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器,，從平板內切取菌落圓塊,，放入含有保護劑的安瓿管內，然后用火焰熔封,。浸入水中檢查有無漏洞,。
4. 凍結再將已封口的安瓿管以每分鐘下降 1℃的慢速凍結至-30℃。若細胞急劇冷凍,，則在細胞內會形成冰的結晶,，因而降低存活率。
5. 保藏經凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內,，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內,。液氮保藏器內的氣相為-150℃，液態(tài)氮內為-196℃,。
6. 恢復培養(yǎng)保藏的菌種需要用時,，將安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中進行急劇解凍,，直到全部融化為止,。再打開安瓿管，將內容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng),。

?6 冷凍干燥保藏法

1. 準備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造,，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管(圖Ⅶ-15),，大小要求外徑 6—7.5mm,，長 105mm,，球部直徑 9—11mm，壁厚 0.6—1.2mm,。也可用沒有球部的管狀安瓿管,。塞好棉塞，1.05kg/cm2>,，121.3℃滅菌 30 分鐘,，備用。
2. 準備菌種,，用冷凍干燥法保藏的菌種,，其保藏期可達數年至十數年，為了在許多年后不出差錯,，故所用菌種要特別注意其純度,，即不能有雜菌污染，然后在zui適培養(yǎng)基中用zui適溫度培養(yǎng),，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物,。細菌和酵母的菌齡要求超過對數生長期，若用對數生長期的菌種進行保藏,，其存活率反而降低,。一般，細菌要求 24—48 小時的培養(yǎng)物;酵母需培養(yǎng) 3 天;形成孢子的微生物則宜保存孢子;放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng) 7—10 天,。
3. 制備菌懸液與分裝以細菌斜面為例,，用脫脂牛乳 2ml 左右加入斜面試管中，制成濃菌液,，每支安瓿管分裝 0.2ml,。
4. 冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價值昂貴,，此處介紹的是簡易方法與裝置,，可達到同樣的目的。將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍,，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體 CO2>)酒精液或干冰丙酮液,，溫度可達-70℃。將安瓿管插入冷凍劑,，只需冷凍 4—5 分鐘,，即可使懸液結冰。
5. 真空干燥為在真空干燥時使樣品保持凍結狀態(tài),，需準備冷凍槽,，槽內放碎冰塊與食鹽，混合均勻,，可冷至-15℃,。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內,。抽氣一般若在 30 分鐘內能達到 93.3Pa(0.7mmHg)真空度時,，則干燥物不致熔化，以后再繼續(xù)抽氣,，幾小時內,，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度 26.7Pa(0.2mmHg),，保持壓力6—8 小時即可,。封口抽真空干燥后，取出安瓿管,，接在封口用的玻璃管上,，可用 L 形五通管(圖Ⅶ-17)繼續(xù)抽氣，約 10 分鐘即可達到 26.7Pa(0.2mmHg),。于真空狀態(tài)下,，以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口。封口以后,，保存于冰箱或室溫暗處,。