細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以zui大限度的保存細(xì)胞活力,。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑,，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法,，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化,，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

細(xì)胞

D-Hanks液小牛血清培養(yǎng)液青霉素鏈霉素胰蛋白酶HClNaHCO3DMSO甘油

微量加樣槍吸頭離心管凍存管槍頭膠塞移液管玻璃瓶紅血球計(jì)數(shù)板記號(hào)筆醫(yī)用橡皮膏移液槍超凈工作臺(tái)離心機(jī)恒溫水浴箱冰箱倒置相差顯微鏡培養(yǎng)箱液氮冰箱

1.  儀器：凈化工作臺(tái),、 離心機(jī),、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃,、-70℃）,、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱,、液氮冰箱,。

2.  玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）,、 培養(yǎng)瓶,、玻璃瓶（250ml、100ml）,、廢液缸,。

3.  塑料器皿： 吸頭、槍頭,、膠塞,、移液管（10ml）、15ml離心管,、凍存管（1～2ml）,。

4.  其他物品：微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板,、記號(hào)筆,、醫(yī)用橡皮膏、移液槍,。

5.  試劑：D-Hanks液,、小牛血清、培養(yǎng)液,、雙抗（青霉素,、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）,、1NHCl,、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無(wú)色新鮮甘油,。

二,、細(xì)胞凍存

1.  配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液,。

2.  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái),，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中,。

3.  離心1 000 rpm，5 min,。

4.  去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液,，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù),，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的zui終密度為5×10⁶/ml～1×10⁷/ml,。

5.  將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml,。

6.  在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱,，凍存時(shí)間及操作者。

7.  凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min,；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí),，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時(shí),，則可迅速浸入液氮中,。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜,，取出凍存管,，移入液氮容器內(nèi)。

三,、 細(xì)胞復(fù)蘇

1.  從液氮容器中取出凍存管,，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化,。

2.  從37℃水浴中取出凍存管,，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液,，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,，混勻。

3.  離心,， 1 000 rpm,，5 min。

4.  棄去上清液,，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度,，接種培養(yǎng)瓶,，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

5.  次日更換一次培養(yǎng)液,，繼續(xù)培養(yǎng),。

1.  從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液,。

2.  將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí),，要做好防護(hù)工作，以免凍傷,。
 

3.  凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液,。

一、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下,，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水,，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶,。

如果緩慢冷凍,，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶,；相反,，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜,、綱胞器的損傷和破裂,。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶,，即冰晶的重結(jié)晶,。

二、慢凍程序

1.  標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細(xì)胞凍存器

當(dāng)溫度在-25 ℃以上時(shí),，  1~2 ℃/min,；

當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時(shí)， 5~10 ℃/min,；

當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí),，可迅速放入液氮中。

2.  簡(jiǎn)易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi),，紗布袋系以線繩,，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度,，在40 min內(nèi)降至液氮表面過(guò)夜,，次晨投人液氮中。

3.  傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。

三,、低溫保護(hù)劑的應(yīng)用

在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果,。

常用的低溫保護(hù)劑是DMSO,，它是一種滲透性保護(hù)劑,，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性,，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程,，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外,，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶,，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷,。

四、細(xì)胞凍存方法

1.  預(yù)先配制凍存液

（1）10%DMSO + 細(xì)胞生長(zhǎng)液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

（2）10%甘油+ 細(xì)胞生長(zhǎng)液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

2.  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,，經(jīng)胰酶消化后,，加入適量?jī)龃嬉海?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×10⁶ ~ 5 ×10⁶細(xì)胞/ml）。

3.  加入1 ml細(xì)胞于凍存管中,，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期,。液氮長(zhǎng)期保存。

五,、保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法

1.  快速解凍

凍存細(xì)胞從液氮中取出后,，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管,，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過(guò)3 分鐘）,。

2.  解凍后的細(xì)胞可直接接種到含*生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后再用新鮮*培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液,，以去除DMSO,。

3.  如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感

解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過(guò)離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含*生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,。