Megazyme 比色法用低聚糖 FAQs （3）

Q: 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（o-PNPBG）如何用于檢測β-葡萄糖苷酶,？

A: 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷按以下規(guī)程用于β-葡萄糖苷酶檢測,，不過緩沖溶液可以配合受檢的酶溶液的pH值進(jìn)行調(diào)整,。

所需材料:

緩沖溶液: - 0.1 M 醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.0)。

酶底物溶液: 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（10mM）,。
稱量301毫克的4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷,，加入150 ml耐熱燒杯中，加入95毫升0.1M的醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.0),。攪拌溶液直至底物*溶解（大約10分鐘）,。用0.1M的醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.0)調(diào)節(jié)體積至100毫升。加入0.02 g疊氮鈉以防止微生物污染,。將溶液儲(chǔ)存于一個(gè)密閉的Duran瓶中,。日常使用時(shí)取10毫升加入聚丙烯試管中。注意不要頻繁從酶底物儲(chǔ)備液中取用,。 所有容器都應(yīng)置于4攝氏度下儲(chǔ)存,。

酶制備液:
用GILSON的微量移液器將1.0毫升均勻的酶懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)100毫升的容量瓶中，然后用0.1M的醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.0)定容,。接下來按照0.5毫升酶溶液和4.5毫升緩沖液的比例（10倍）稀釋酶制備液,，混合均勻，重復(fù)上述步驟直至獲得適合分析的稀釋液,。

上述操作推薦使用Gilson移液器,，預(yù)設(shè)0.5ml，用于轉(zhuǎn)移酶制備液,；Eppendorf多道移液器用于轉(zhuǎn)移4.5ml緩沖液（5道設(shè)置為2.5毫升,，4道設(shè)置為2毫升）。

檢測過程:

40攝氏度下,，預(yù)培養(yǎng)置于玻璃試管(16 x 100 mm)中的酶底物溶液（0.2毫升）5分鐘

40攝氏度下,，預(yù)培養(yǎng)酶稀釋溶液（約5毫升）5分鐘。

嚴(yán)格按時(shí)間間隔（大約15秒）,，往含有0.2毫升底物溶液的試管底部加入0.2毫升酶溶液,，劇烈震蕩混合試管內(nèi)容物，然后培養(yǎng)試管（一式四份）10分鐘左右,。

培養(yǎng)結(jié)束前,，加入3.0毫升2%的磷酸三鈉溶液(pH 12.0)終止反應(yīng)，并劇烈攪拌,。

準(zhǔn)備反應(yīng)空白溶液（一式兩份）,，將3.0毫升2%的磷酸三鈉溶液(pH 12.0)加入0.2毫升底物溶液中，劇烈攪拌,。然后加0.2毫升酶溶液,，劇烈攪拌。

按以下步驟測量吸光度值(400 nm):

- 用蒸餾水校正分光光度計(jì)的零點(diǎn)
- 檢測反應(yīng)空白樣相對于水的吸光度，并記錄(僅供參考).
- 用蒸反應(yīng)空白樣校正分光光度計(jì)的零點(diǎn)
- 檢測所有其它溶液相對于反應(yīng)空白樣的吸光度

活性計(jì)算公式如下:

1個(gè)單位酶活性,，是每分鐘在*pH和40攝氏度下將1微摩爾PNP底物水解成pNP和底物所需要的酶的數(shù)量,。

按以下公式進(jìn)行計(jì)算:

Units/mL = (ΔE400 /10)×(3.4/0.2）× (1/18.1)×（100/1.0）×稀釋體積
= ΔE400×9.39×稀釋體積

此處:

ΔE400 = 吸光度 (反應(yīng)) – 吸光度(空白)

培養(yǎng)時(shí)間 = 10分鐘

細(xì)胞總體積 = 3.4 毫升

檢測等分 = 0.2 毫升

對硝基酚在2%磷酸三鈉溶液中的EmM值 = 18.1

萃取體積 = 總體積為100毫升的萃取原液中有1.0毫升的酶

稀釋體積 = 萃取原液進(jìn)一步稀釋體積

注意:- 對于40 Units/ml的β-葡萄糖苷酶溶液來說，進(jìn)一步稀釋“萃取原液”意味著稀釋至10倍,。