第四節(jié) 肌組織細胞培養(yǎng)

各種肌組織均可用于培養(yǎng)，以心肌和骨骼肌較實用,。

（－）骨骼肌細胞培養(yǎng)

1,、出生1一2天的乳鼠，引頸處死,。

2,、無菌取大腿肌組織，切成0.3一0.5cm2小塊后,，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過。

3,、計數(shù)調(diào)整細胞密度,。

4、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng),。

5,、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進分化,。

接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化,，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠。

該細胞接種率約50%,，細胞生長開始呈紡錘形,，培養(yǎng)50－52小時后出現(xiàn)融合形成肌細胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止,，此時可觀察到橫紋,，一般在融合后二、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象,。

（二）心肌細胞培養(yǎng)

心肌細胞是zui早的培養(yǎng)材料,，Carrel曾長期培養(yǎng)過心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物,，zui常用的是雞胚心肌,。

心肌比較容易培養(yǎng)和生長，可用懸滴培養(yǎng),、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法,，均可獲良好的效果,。取心室肌培養(yǎng)較好，原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形,，培養(yǎng)成功時,，一周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。

第五節(jié) 巨噬細胞培養(yǎng)

巨噬細胞屬免疫細胞,，有多種功能,，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象,。巨噬細胞容易獲得,，便于培養(yǎng)，并可進行純化,。巨噬細胞屬不繁殖細胞群,，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng),，難以長期生存。

巨噬細胞也建有無限細胞系,，大多來自小鼠,，如P331、S774A.1,、RAW309Cr.l等,，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細胞形態(tài)和吞噬功能,，易于傳代和瓶壁分離,，但難以建株。

培養(yǎng)巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞,，以小鼠腹腔取材法zui為實用,，其法如下：

1、實驗前三天,，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內(nèi)?。源塘鳟a(chǎn)生大量的巨噬細胞,。

2,、引頸處死小鼠。

3,、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒,。

4、置動物于解剖臺,，用針頭固定四肢,，持鑷撕開腹部皮膚,，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側(cè),，暴露出腹膜壁,。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁,，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,，同時用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動,。

6,、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。

7,、小心拔出針頭,，把液體注入離心管。

8,、4℃下250g離心10分鐘后,，去上清，加10ml Eagle培養(yǎng)基,。

9,、計數(shù)細胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細胞,，其中90%為巨噬細胞,。

10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種,。

11,、接種數(shù)小時后，除去培養(yǎng)液,，可去除其它白細胞,，純化培養(yǎng)細胞，用Eagle液沖洗1一2次,，再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中,。 

第六節(jié) 腎小球分離、移植培養(yǎng)

SD大鼠頸椎脫臼法處死,，75%乙醇浸泡1～2分鐘,，2次，置超凈臺內(nèi),，打開腹腔取出腎臟剪碎,，置含Hank's液的無菌培養(yǎng)皿洗滌，置80目不銹鋼篩網(wǎng)上,。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過篩網(wǎng),，濾過組織Hank's液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng),，濾過，去小組織塊,，濾過物吸至200目不銹鋼篩網(wǎng),，輕輕濾過，Hank's液洗滌1次,，收集網(wǎng)上腎小球,，鏡下觀察為分離良好的腎小球。

腎小球用0.2%胰酶,、0.1%膠原酶,，37℃消化20分鐘，加血清終止胰酶反應(yīng),，離心除去膠原酶,。處理過的腎小球計數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶，使腎小球大于60個/cm2,，加培養(yǎng)基5～10ml（培養(yǎng)基組成：F12—3T3上清1：1,；5%馬血清；2.5%胎牛血清,；胰島素5μg/ml,；25ng/ml氫化可d松；5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白,；25ng/ml前列腺素E1,；甲狀腺素0.02ng/ml,；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養(yǎng)8～10天,，去除腎小球未生長組分，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時,，形態(tài)學(xué)觀察：細胞生長成單層多角型細胞,，直徑約100μm。

第七節(jié) 裸小鼠移植瘤單細胞分離培養(yǎng)

無菌條件下取出小鼠移植瘤組織,，剪成1mm3小塊,，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘,，在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成,，濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細胞）來回推動注射器吹打組織以分離單細胞，終止酶消化方法同上,。

常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細胞,。