Western免疫印跡（Western Blot）

Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,，然后利用抗體進(jìn)行檢測,。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測,，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物,，可通過融合部分的抗體檢測。
本文主要通過以下幾個(gè)方面來詳細(xì)地介紹一下Western Blot技術(shù):
一,、原理
二,、 分類
i.放射自顯影
ii.底物化學(xué)發(fā)光ECL
iii.底物熒光ECF
iv.底物DAB呈色
三、 主要試劑
四,、 主要步驟
五,、 實(shí)驗(yàn)常見的問題指南
1.參考書推薦
2.針對樣品的常見問題
3.抗體
4.濾紙、膠和膜的問題
5.Marker的相關(guān)疑問
6.染色的選擇
7.參照的疑問
8.緩沖液配方的常見問題
9.條件的摸索
10.方法的介紹
11.結(jié)果分析

一,、 原理
與Southern或Northern雜交方法類似,，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì),，“探針”是抗體,，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上,，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變,。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分,。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

二,、分類

現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色,，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用*種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL,。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行,，操作也比較簡單,，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP,，即發(fā)光,，可使膠片曝光，就可洗出條帶,。 

三,、主要試劑
1、 丙烯酰胺和N,，N’-亞甲雙丙烯酰胺,，應(yīng)以溫?zé)幔ㄒ岳谌芙怆p丙稀酰胺）的去離子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和1%（w/v）N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g,，N,，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml,。）儲于棕色瓶,，4℃避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過7.0,，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的,。使用期不得超過兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制,。如有沉淀,，可以過濾。
2,、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%（w/v）0.1gSDS,，1mlH2O去離子水配制，室溫保存,。
3、 分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL（pH8.8）:18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合,，加水稀釋到100ml終體積,。過濾后40C保存。
4,、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL（pH6.8）:6.05gTris溶于40mlH2O中,，用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存,。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備,，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris.CL,。
5,、 TEMED原溶液N,，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合,。PH太低時(shí),，聚合反應(yīng)受到抑制。10%（w/v）過硫酸胺溶液,。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基,。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.
6,、 SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml,，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml,，巰基乙醇3.2ml,，0.05%溴酚藍(lán)1.6ml，H2O 32ml混勻備用,。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合,，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul,，總蛋白量100μg,。
7、 Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris,，188g甘氨酸,，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml,，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液,。臨用前稀釋10倍。
8,、 轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液,，需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿,、0.37g SDS,，并加入200ml甲醇，加水至總量1L,。
9,、 麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時(shí)上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄,。
10,、 脫脂奶粉5%（w/v）。
11,、 NaN3 0.02% 疊氮鈉（有毒,，戴手套操作）,，溶于磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。
12,、 Tris緩沖鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCL（pH7.5）,，500mmol/LnaCl。
13,、 Tween20（15）鼠抗人-MMP-9（16）鼠抗人-TIMP-1,。
14、 過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體,。
15,、 NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）,。
16,、 BCIP（溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml）,。
17,、 100mmol/LTris-HCL（pH9.5）。
18,、 100mmol/L NaCl,。
19、 50mmol/LTris-HCL（pH7.5）,，5mmol/L EDTA,。
（可以參看分子克隆）