體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí),，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似,，但由于物種,、個(gè)體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同,，各自要求條件有一定差別,，所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施亦不盡相同,，現(xiàn)介紹個(gè)別組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點(diǎn)如下:

*節(jié) 上皮細(xì)胞培養(yǎng)

上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝,、胰、乳腺等的功能成分,，又由于癌起源于上皮組織,，故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中常混雜有成纖維細(xì)胞,，培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度往往超過(guò)上皮細(xì)胞,，并難以純化，同時(shí)上皮細(xì)胞難以在體外長(zhǎng)期生存,，因此純化和延長(zhǎng)生存時(shí)間是培養(yǎng)關(guān)鍵,。

體內(nèi)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在膠原構(gòu)成的基膜,，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長(zhǎng),，另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線(xiàn)照射后）時(shí)，細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象,。降低PH,、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子,，均有利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng),。

以表皮細(xì)胞為例，用皮膚表皮和分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞,，其法如下（黑木凳志夫 1981）

1,、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好,，取角化層薄者,，切成0.5－1平方厘米小塊。

2,、置0.02%EDTA中,，室溫，5分鐘,。

3,、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過(guò)夜,。

4,、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與層分開(kāi),。

5,、取出表皮，剪成更小的塊后,，置0.25%胰酶中,，37℃，30—60分鐘,。

6,、反復(fù)吹打，制成懸液。

7,、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后,，低速離心，吸去上清,。

8,、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶,，CO2溫箱培養(yǎng),。

第二節(jié) 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞，對(duì)于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞再生,、腫瘤促血管生長(zhǎng)因子（TAF）等有很大價(jià)值,。

研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法zui為簡(jiǎn)便，其法如下：

1,、產(chǎn)后新鮮臍帶,，無(wú)菌剪取10—15厘米長(zhǎng)一段，如不能立即培養(yǎng),，可于12小時(shí)內(nèi)保存于4℃,。

2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血,，在入口處用線(xiàn)繩扎緊,，以防液體返流。

3,、用血管鉗夾緊臍帶一端,，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿(mǎn)血管,，消化3—10分鐘,；注入口用線(xiàn)繩扎，以防液體返流,。

4,、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，于離心管中,，注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后,，一并注入離心管中（此步驟可重復(fù)）。

5,、離心去上清,，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中,，置溫箱培養(yǎng),。兩至三天可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)成單層,。

第三節(jié) 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)

神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下,，如接種在膠原底層上,，或加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，可出現(xiàn)一定程度的分化,，長(zhǎng)出突起等現(xiàn)象,，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分,。

人,、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞,，也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系,。一般說(shuō)來(lái)，膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長(zhǎng)不穩(wěn)定,，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對(duì)外界因素仍保持很好的敏感性,，可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化,。

一、設(shè)備： 無(wú)菌操作設(shè)備,。

二,、大型設(shè)備CO2培養(yǎng)箱：恒溫5%、10%CO2維持培養(yǎng)液中pH值,。

倒置顯微鏡：用于每天觀(guān)察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)情況,。

解剖顯微鏡，用于準(zhǔn)確地取材,。

常溫冰箱：-4℃,，用于保存各種培養(yǎng)液，解剖液和鼠尾膠,。

低溫冰箱：-20℃--80℃,，用于儲(chǔ)存血清酶，貴重物品和試劑,。

電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿,。 

高壓消毒鍋：用于消毒培養(yǎng)皿，手術(shù)器械,。

過(guò)濾器：配制解剖液,、培養(yǎng)液，必須過(guò)濾后才可使用,，以去除細(xì)菌,。

滲透壓儀，pH劑，天平等,。

三,、培養(yǎng)器皿及手術(shù)器械

1、培養(yǎng)皿：常用35mm塑料及玻璃皿,，解剖取材用15mm-90mm直徑,。

2、培養(yǎng)板,，24-40孔,，可用于開(kāi)放培養(yǎng)。

3,、培養(yǎng)瓶：

4,、吸管，常用1,，5,，10ml，均需泡酸,、洗滌,、滅菌后方可使用。

5,、各類(lèi)培養(yǎng)液貯存器,。

6、小型手術(shù)器械,。

準(zhǔn)備：

一,、配制培養(yǎng)液

（1）解剖液：以無(wú)機(jī)鹽（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值,。

（2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MEM）：主要為多種氨基酸,，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解,。

（3）接種培養(yǎng)液：用于胰酶消化后的細(xì)胞分散,，做成細(xì)胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺,，另加入10%馬血清,，當(dāng)天配制。

（4）維持培養(yǎng)液：接種后24h,，全部換成此液,，后每2周換一次，每次換1/2,。其成分為MEM中含5%馬血清,，1%谷氨酰胺,，及適量的支持性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

二,、培養(yǎng)基質(zhì) 常用鼠尾膠,、小牛皮膠，多聚賴(lài)氨酸,，再涂膠

三,、消毒培養(yǎng)皿的備用。所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗2-3d,，達(dá)兩次ddH2O,，每遍洗刷3-4次，加塞包裝,，置于烤箱中干燥消毒,，于培養(yǎng)前1天進(jìn)行。

神經(jīng)細(xì)胞分散培養(yǎng)

（一）選材 常用胚胎動(dòng)物或新生鼠神經(jīng)組織,。雞胚常用胚齡6-8d,，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過(guò)也有認(rèn)為與組織相關(guān),。如大白鼠胚胎以19d為宜,，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜,；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d,，紋狀體18-21d為宜,；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細(xì)胞成活率高,，顆粒細(xì)胞正在分化,；脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng)，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎,，取材易,，神經(jīng)成活率高。

（二）取材,。腦則取出相應(yīng)組織,，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化,。脊髓則固定于瓊脂板上,，用小刀將其要成背腹兩側(cè)，分別培養(yǎng),。

（三）細(xì)胞分離與接種,。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min,，移入接種液，停止消化,，并洗去胰蛋白酶液,，用細(xì)口吸管吹打細(xì)胞懸液，使其充分分散,，如此多次,，待沉淀后吸出上層細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù),，預(yù)置細(xì)胞密度,，接種于培養(yǎng)皿（1×106），做電生理應(yīng)為5×105或更低,。

（四）抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng),。培養(yǎng)3-5d后，也有人認(rèn)為培養(yǎng)7d后,，用阿糖胞苷,，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

（五）觀(guān)察,。接種6-12h,，開(kāi)始貼壁，并有集合現(xiàn)象,，細(xì)胞生長(zhǎng)突起明顯,，5-7d膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，7-10d膠質(zhì)細(xì)胞成片于神經(jīng)細(xì)胞下面,，形成地毯,，2周時(shí)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)zui豐滿(mǎn)，四周暈光明顯,，一個(gè)月后,，有些神經(jīng)細(xì)胞開(kāi)始退化，變形,，甚至出現(xiàn)空泡,，一般培養(yǎng)2-4周zui宜。

但神經(jīng)細(xì)胞只能增大,，而不能增殖,，只能原代，不能傳代,，不會(huì)有細(xì)胞周期,，而且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量在下降,，但膠質(zhì)細(xì)胞可以,，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可以,。在培養(yǎng)過(guò)程中，早期9-12d時(shí),，有較多的神經(jīng)細(xì)胞死亡,，這是*次死亡階段，應(yīng)注意保持條件的恒定,。在此之后存活下去的細(xì)胞一般突起長(zhǎng)而多,，且相互形成突觸。

（六）常用培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)有：FCM的蛋白總量分析,；膜片鉗與離子通道的分析,；免疫組化分析；

但免疫組化分析應(yīng)注意,，由于抗體直接作用于活細(xì)胞,，不易穿透活細(xì)胞，故對(duì)核內(nèi)抗原定位時(shí),，首先考慮膜對(duì)抗體的通透性問(wèn)題,。常用化學(xué)試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。

在免疫組化中,，或其它組織學(xué)染色中,，常用不同的染色方法以區(qū)分不同細(xì)胞，如半乳糖腦苷脂對(duì)小樹(shù)突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記明顯,；GFAP對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有特異性染色等,。這對(duì)研究神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞功能具有極大的應(yīng)用價(jià)值。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以往多被忽視,，其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷）、退行性疾?。ㄈ鏏D、PD）,、損傷后膠質(zhì)細(xì)胞的填充等具有不可忽視的作用,。它也是神經(jīng)細(xì)胞功能和營(yíng)養(yǎng)支持的物質(zhì)基礎(chǔ)。