*節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)

一,、基本概念通常,，體外培養(yǎng)的生物成分無(wú)外乎兩種結(jié)構(gòu)形式：

其一是小塊組織或稱為組織塊（tissue block），一般稱為外植塊,；

其二是將生物組織分散后制成的單個(gè)細(xì)胞,，一般稱為分離的細(xì)胞(isolated cell)或者分散的細(xì)胞(dissociated cell)。

分散的過(guò)程通常在培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中進(jìn)行,，分散的細(xì)胞被懸浮于培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中,。

單個(gè)細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中,，就稱為細(xì)胞懸液(cell suspension),。

狹義的細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)主要是指分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)，廣義的細(xì)胞培養(yǎng)的概念還包括單（個(gè)）細(xì)胞培養(yǎng)(single cell culture),。一種是群體培養(yǎng)（mass culture）,，將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層,；另一種是克隆培養(yǎng)（clonal culture）,，將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后,，彼此距離較遠(yuǎn),，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克?。╟lone）,。一個(gè)細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來(lái)源于同一個(gè)祖先細(xì)胞。

現(xiàn)今,，用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基本有3類,，即原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株及傳代細(xì)胞系,。經(jīng)過(guò)幾十年的研究和發(fā)展,，目前我國(guó)已經(jīng)擁有了可以進(jìn)行大規(guī)模疫苗生產(chǎn)的動(dòng)物原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和Vero細(xì)胞等生產(chǎn)技術(shù),，用于生產(chǎn)多種人用,、動(dòng)物疫苗。其中二倍體細(xì)胞（如我國(guó)70年代建立的人胚肺二倍體細(xì)胞株KMB17和2BS）對(duì)多種病毒具有廣泛的敏感性,，用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細(xì)胞時(shí)在其培養(yǎng)物中可能存在的各種潛在致病因子的,，是當(dāng)前病毒性疫苗生產(chǎn)較為理想的細(xì)胞基質(zhì)。Vero細(xì)胞是1962年由日本Chiba大學(xué)的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的,，是一種貼壁依賴性成纖維細(xì)胞,，核型為2n 60，高倍體率約為1.7%,，可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng),，不含任何污染因子。通常使用199培養(yǎng)基添加5%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng),。該細(xì)胞可用于多種病毒的增殖,，已被WHO批準(zhǔn)廣泛用于人用、動(dòng)物用疫苗生產(chǎn),。 

二,、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型

（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞,，大致分成以下四型：

1、成纖維細(xì)胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形,，*有卵圓形核,，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀,。除真正的成纖維細(xì)胞外,，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織,，如心肌、平滑肌,、成骨細(xì)胞,、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞,。

2,、上皮型細(xì)胞：細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，*有圓形核,，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜,。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連,，很少單獨(dú)行動(dòng),。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物,、消化管上皮,、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài),。

3,、游走細(xì)胞型：呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片,，胞質(zhì)常突起,，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則,。此型細(xì)胞不穩(wěn)定,，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。

4,、多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞,，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類,。

（二）懸浮型:見于少數(shù)特殊的細(xì)胞,，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形,，不貼于支持物上,，呈懸浮生長(zhǎng)。這類細(xì)胞容易大量繁殖,。

三,、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程:體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶,、皿或其它容器,，生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的,。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營(yíng)養(yǎng)液,，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存,，這一過(guò)程叫傳代（Passage或Subculture）。每次傳代以后,，細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程都會(huì)受一定的影響,。另外，很多細(xì)胞在體外的生存也不是無(wú)限的,，存在著一個(gè)發(fā)展過(guò)程,。所有這一切，使組織細(xì)胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點(diǎn),。

（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期（Life Span of Culture Cells）:所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期,，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致,。人胚二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng),，在不凍存和反復(fù)傳代條件下，可傳30～50代,，相當(dāng)于150～300個(gè)細(xì)胞增殖周期,，能維待一年左右的生存時(shí)間，zui后衰老凋亡（Apoptosis）,。如供體為成體或衰老個(gè)體,，則生存時(shí)間較短；如培養(yǎng)的為其它細(xì)胞,如肝細(xì)胞或腎細(xì)胞,，生存時(shí)間更短,，僅能傳幾代或十幾代。只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變,，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時(shí),，細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變。正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),，不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何,，在細(xì)胞全生存過(guò)程中，大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段：

1,、原代培養(yǎng)（Primary Culture）期：也稱初代培養(yǎng),，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到*次傳代階段，一般持續(xù)1一4周,。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng),，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大,。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同,，細(xì)胞相互依存性強(qiáng),。

2、傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（Cell Line）,。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間zui長(zhǎng),。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛,，并能維持二倍體核型,，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì),，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存,。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存,，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度,，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化,。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右,，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至*停止,，細(xì)胞進(jìn)入第三期,。

3、衰退期：此期細(xì)胞仍然生存,，但增殖很慢或不增殖,；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，zui后衰退凋亡,。

在細(xì)胞生命期階段,，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期）,，由于某種因素的影響,，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）,。細(xì)胞永生性也稱不死性,，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系（Infinite Cell Line）,，也稱連續(xù)細(xì)胞系（Continuous Cell Line）,。無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段,。細(xì)胞獲不死性后,，核型大多變成異倍體（Heteroploid）,。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì),。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀,。

（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期 所有體外培養(yǎng)細(xì)胞，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系,，當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后,，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì),、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān),。接種細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞基數(shù)大,、相同增殖速度條件下,，細(xì)胞數(shù)量增加與飽和速度相對(duì)要快（實(shí)際上細(xì)胞接種數(shù)量大時(shí)細(xì)胞增殖速度比時(shí)要快）。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系比初代培養(yǎng)細(xì)胞增殖快,，培養(yǎng)液中血清含量多時(shí)細(xì)胞增殖比少時(shí)快,。以上情況都會(huì)縮短傳代時(shí)間。

所謂細(xì)胞“一代”一詞,，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間,，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義,。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞,，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增〔Doubling〕不同,；在細(xì)胞一代中,，細(xì)胞能倍增3～6次。

細(xì)胞傳一代后,，一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段：

1,、潛伏期（Latent Phase）：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期,。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮,，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上,，稱貼壁,，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同,，這與細(xì)胞的種類,、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長(zhǎng)達(dá)10～24小時(shí)或更多,；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快,，10～30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個(gè)非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過(guò)程,。支持物能影響細(xì)胞的貼附,；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽(yáng)性電荷利于貼附,。另外在貼附過(guò)程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素（Fibronectin）,，又稱LETS（Larger External Transformation Substance）,，細(xì)胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過(guò)程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分,，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面（如CSP）,，有的則來(lái)自培養(yǎng)基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì),。貼附是貼附類細(xì)胞生長(zhǎng)增殖條件之一,。

細(xì)胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過(guò)前述延展過(guò)程變成極性細(xì)胞,，還要經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段,，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí),，可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng),，基本無(wú)增殖，少見分裂相,。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度,、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng),，約24～96小時(shí)或更長(zhǎng),，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時(shí),；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短,。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期,。

2,、指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：這是細(xì)胞增值z(mì)ui旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多,。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志,。一般以細(xì)胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類,、培養(yǎng)液成分,、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響,。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%,，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%,。pH和培養(yǎng)液血清含量變動(dòng)對(duì)細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響,。指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力的時(shí)期，因此是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的和zui主要的階段,。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下,，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多,、生長(zhǎng)空間漸趨減少,、zui后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后,，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞,，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）,。而惡性細(xì)胞則無(wú)接觸抑制現(xiàn)象,，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。腫瘤細(xì)胞由于無(wú)接觸抑制能繼續(xù)移動(dòng)和增殖,，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展,，使細(xì)胞發(fā)生堆積（Piled up）。細(xì)胞接觸匯合成片后,，雖發(fā)生接觸抑制,，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂,，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多,。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少,，代謝產(chǎn)物增多時(shí),，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition）,，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止,。因此細(xì)胞接觸抑制和密度抑制是兩個(gè)不同的概念，不應(yīng)混淆,。

3,、停滯期（Stagnate Phase）：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后,，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期,。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加,，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖,，但仍有代謝活動(dòng),，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累,、pH降低,。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒,，發(fā)生形態(tài)改變,，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好,。傳代過(guò)晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下,，雖進(jìn)行了傳代,，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù),，至少還要再傳1～2兩代,，通過(guò)換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用,。結(jié)果反而耽誤了時(shí)間,，這是在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)特別注意的。

四,、原代培養(yǎng):即*次培養(yǎng),，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長(zhǎng)環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過(guò)程,。有幾方面含義：

培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿（瓶）中就不在分割,，任其生長(zhǎng)繁殖；

原代培養(yǎng)中的“代”并非細(xì)胞的“代”數(shù),，因?yàn)榕囵B(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞經(jīng)多次分裂已經(jīng)產(chǎn)生多代子細(xì)胞,； 

原代培養(yǎng)過(guò)程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿,。

正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限,，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無(wú)限生長(zhǎng)下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細(xì)胞,。目前世界上許多實(shí)驗(yàn)室所廣泛傳用的HeLa細(xì)胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成,。此細(xì)胞系一直延用至今,。

原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細(xì)胞的生長(zhǎng)就會(huì)出現(xiàn)停滯,，大部分細(xì)胞衰老死亡,。但是有極少數(shù)的細(xì)胞能夠度過(guò)“危機(jī)”而繼續(xù)傳下去，這些存活的細(xì)胞一般能夠傳到40～50代,，這種傳代細(xì)胞叫做細(xì)胞株,。細(xì)胞株的遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變,在培養(yǎng)過(guò)程中其特征始終保持。當(dāng)細(xì)胞株傳至50代以后又會(huì)出現(xiàn)“危機(jī)”,，不能再傳下去,。但是有部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，并且?guī)в邪┳兊奶攸c(diǎn),，有可能在培養(yǎng)條件下無(wú)限制地傳代下去,，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。

原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系（株）必經(jīng)的階段,，其是否成功與組織污染與否,、供體年齡、培養(yǎng)技術(shù)和方法,、適宜培養(yǎng)基的選擇等多種因素有關(guān),。由于原代培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化性極小，對(duì)病毒敏感性好,，因此適應(yīng)制備疫苗等生物制品,；但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標(biāo)本,、且受供體年齡健康狀況的影響而導(dǎo)致批間差異大等缺陷,。目前常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)有雞胚成纖維細(xì)胞及豬腎、猴腎,、地鼠腎等原代細(xì)胞,。

原代培養(yǎng)的基本過(guò)程包括取材、培養(yǎng)材料的制備,、接種,、加培養(yǎng)液、置培養(yǎng)條件下培養(yǎng)等步驟,，在所有的操作過(guò)程中,，都必須保持培養(yǎng)物及生長(zhǎng)環(huán)境的無(wú)菌。

多數(shù)情況下,，分散的細(xì)胞若屬于貼壁依賴型細(xì)胞,，就能黏附、鋪展于培養(yǎng)器皿和載體表面生長(zhǎng)而形成細(xì)胞單層,，這種培養(yǎng)方式稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)（monolayer culture）,，又叫貼壁培養(yǎng)（adherent culture）,。少數(shù)情況下，培養(yǎng)的細(xì)胞沒有貼壁依賴性,，可通過(guò)專門設(shè)備使細(xì)胞始終處于懸狀態(tài)而在體外生長(zhǎng),，這種形式稱為懸浮培養(yǎng)（suspension culture）。如何讓接種的細(xì)胞盡快貼壁,，是決定培養(yǎng)成功的關(guān)鍵步驟：

取決于適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)基質(zhì)表面,；

可降低接種后培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞的浮力，如先少補(bǔ)加少量培養(yǎng)液,，待細(xì)胞貼壁后再補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),；

注意適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種密度，一般105個(gè)/ml左右,。

五,、傳代培養(yǎng):當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂,，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制,，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止；另一方面也會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長(zhǎng)或發(fā)生中毒,。此時(shí)就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分,，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng),。這個(gè)過(guò)程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對(duì)單層培養(yǎng)而言,，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段,。

體外培養(yǎng)技術(shù)中所謂的傳“代”概念并不等于細(xì)胞生物學(xué)中“親代細(xì)胞”與“子代細(xì)胞”中“代”的概念。傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是分割后再一次培養(yǎng),，可以相對(duì)地衡量培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡,。

六、生長(zhǎng)曲線:細(xì)胞接種入培養(yǎng)瓶后,，*入2-24h的延遲期（lag period）,，然后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期（即對(duì)數(shù)期）（log phase），匯合成單層進(jìn)入緩慢生長(zhǎng)或停滯期（即平臺(tái)期）（plateau lhase）,。每種細(xì)胞系（cell line）的這些生長(zhǎng)期（growth phase）都是特征性的,，只要環(huán)境條件保持恒定，每一次測(cè)定結(jié)果應(yīng)該是可重復(fù)的,。

第二節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù)

一,、從原代組織中分離細(xì)胞 將組織塊分離（散）成細(xì)胞懸液的方法有多種，zui常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法,、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法,。

從原代組織中獲得單細(xì)胞懸液的一般方法是酶解聚,。細(xì)胞暴露在酶中的時(shí)間要盡可能的短，以保持zui大的活性,。下列步驟可以解聚整個(gè)組織,，獲得較高產(chǎn)量的有活性細(xì)胞。

1,、胰蛋白酶 (Trypsin)

在去除不需要的組織后,，使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片，通過(guò)懸浮在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片,。讓組織碎片沉淀,，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次,。

將盛有組織碎片的容器置于冰上,，去除殘留的上清液。加入0.25％溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml 胰蛋白酶）,。

在4℃孵育6到18小時(shí),，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。

移棄組織碎片中的胰蛋白酶,，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘,。

在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織,。如果使用無(wú)血清培養(yǎng)基,，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200mm）過(guò)濾,，分散所有剩余組織,。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng),。 

2,、膠原酶 (Collagenase)

用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次,。

加入膠原酶（50～200單位/ml,，溶解在HBSS中）。

在37℃孵育4到18小時(shí),。加入3mM CaCl2增加解離效率,。

通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞,、組織碎片和較大的碎片,。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶,。

通過(guò)離心在HBSS中清洗懸液幾次,。

再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng),。

3,、Dispase

用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次,。

加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液）

在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí),。

通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞,、組織碎片和較大的碎片,。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase,。

通過(guò)離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次,。

再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞,，進(jìn)行培養(yǎng),。

二、從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞:以下是從基層迅速分離細(xì)胞,，且保持細(xì)胞完整性的一般步驟,。這一步驟并不意味著對(duì)于所有細(xì)胞系的廣泛應(yīng)用，每一種系統(tǒng)*條件和施用濃度應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)加以確定,。

再次培養(yǎng)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的活性,。

細(xì)胞的活率應(yīng)該超過(guò)90％

對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基，降低胰蛋白酶使用量,。

1,、移棄使用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基。

2,、使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細(xì)胞（看表確定正確的清洗溶液）,。在培養(yǎng)瓶對(duì)著細(xì)胞的一面加入清洗溶液,，通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層，然后去除清洗液,。

3,、以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養(yǎng)瓶對(duì)著細(xì)胞的一面,。確保分離液覆蓋細(xì)胞層,。在37℃孵育培養(yǎng)瓶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,。通常,，在5到15分鐘內(nèi),，細(xì)胞就會(huì)脫落。細(xì)胞分離需要的時(shí)間因細(xì)胞系不同而有所變化,。仔細(xì)監(jiān)測(cè)細(xì)胞分離過(guò)程,，避免細(xì)胞受損傷。對(duì)難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細(xì)胞系,，可以輕輕敲打,，以加速分離過(guò)程。

4,、當(dāng)細(xì)胞*分離時(shí),，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部,。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基,，通過(guò)移液管在單層細(xì)胞表面反復(fù)吹打來(lái)分散細(xì)胞。計(jì)數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞,。

5,、對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑,。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性,。

第三節(jié) 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

為了防止因污染或技術(shù)原因使長(zhǎng)期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會(huì)出現(xiàn)變異,，有時(shí)因寄贈(zèng),、交換和購(gòu)買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室,，*的策略是進(jìn)行低溫保存,。這對(duì)于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要。現(xiàn)簡(jiǎn)要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點(diǎn),。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時(shí),，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài),，故可以長(zhǎng)期保存,。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過(guò)0~20℃階段的處理過(guò)程,。在此溫度范圍內(nèi),，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷,。

一,、細(xì)胞的凍存:為避免污染造成的損失，zui小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞,。凍存細(xì)胞前,，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。 

有幾種普通培養(yǎng)基用來(lái)凍存細(xì)胞,。對(duì)于包含有血清的培養(yǎng)基,，成分可能如下：

包含10％甘油的*培養(yǎng)基，

包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養(yǎng)基,，

50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基,，或

50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。

對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基,，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：

50％ 細(xì)胞條件無(wú)血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基,，或

包含有7.5％二甲基亞砜和10％細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)BSA的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基。

1,、懸浮細(xì)胞

計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞,。細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞,，使用移液管移去上清到zui小體積,，不要攪亂細(xì)胞。

以1×107到5×107細(xì)胞/ml密度,，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞,，或者以0.5×107到1×107在無(wú)血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細(xì)胞,。

分裝進(jìn)凍存管,，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟,。

細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍,，可以通過(guò)可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存,。

2,、貼壁細(xì)胞

使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時(shí)盡可能溫和,，使對(duì)細(xì)胞的損傷減少到zui小,。

在*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞,，確定有活力細(xì)胞數(shù)。

以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞,。使用移液管移去上清到zui小體積,，不要攪亂細(xì)胞。

以5×106到1×106細(xì)胞/ml密度,，在凍存液中懸浮細(xì)胞,。

分裝進(jìn)凍存管,，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟,。

細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍,，可以通過(guò)可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存,。

二,、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作,。凍存細(xì)胞要快速融化,，并直接加入*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對(duì)凍存劑（DMSO或甘油）敏感,，離心去除凍存培養(yǎng)基,，然后加入*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。

1,、直接鋪板方法

取出貯存細(xì)胞,，37℃水浴中快速融化。

直接用*生長(zhǎng)培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞,。1ml凍存細(xì)胞使用10~20ml*生長(zhǎng)培養(yǎng)基,。進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3×105活細(xì)胞/ml,。

培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時(shí),，更換新鮮的*生長(zhǎng)培養(yǎng)基，去除凍存劑,。 

2,、離心方法

取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化,。

把1到2ml凍存細(xì)胞加入到大約25ml*生長(zhǎng)培養(yǎng)基,，輕輕混勻。

以大約80x g離心2到3分鐘,。

棄去上清,。

在*生長(zhǎng)培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞，并且進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),。

細(xì)胞鋪板,，細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3×105活細(xì)胞/ml。

三,、細(xì)胞的分化,、衰老與死亡

1、細(xì)胞的分化:一個(gè)成年人全身細(xì)胞總數(shù)約1012個(gè)，可以區(qū)分為200多種不同類型的細(xì)胞：形態(tài)結(jié)構(gòu),，代謝,，行為，功能等各不相同,。追根溯源,，這么多種細(xì)胞均來(lái)自一個(gè)受精卵細(xì)胞。所以,，通常把發(fā)育過(guò)程中,，細(xì)胞后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過(guò)程稱為細(xì)胞分化,。細(xì)胞分化發(fā)生在胚胎階段,，也發(fā)生在胎兒出生以后，乃至成人階段,。例如,，人體血細(xì)胞的產(chǎn)生和分化，這個(gè)過(guò)程在人的一生中一直持續(xù)著,。

由旺盛生長(zhǎng)不斷分裂的細(xì)胞,，轉(zhuǎn)入分化，通常從細(xì)胞周期中G1期開始時(shí)一個(gè)確定的點(diǎn)G0點(diǎn)“逃逸”出細(xì)胞周期,。旺盛生長(zhǎng)分裂的細(xì)胞和各種分化了的細(xì)胞,，它們的基因表達(dá)和代謝活動(dòng)各不相同。

2,、細(xì)胞的衰老:體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明：

成纖維細(xì)胞：來(lái)自胎兒傳代50次后衰老死亡,來(lái)自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān));來(lái)自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來(lái)自烏龜傳代90--125次后衰老死亡,。

細(xì)胞衰老過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列的變化，包括：蛋白質(zhì)合成速度降低,，已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化,，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn)；同時(shí),，細(xì)胞核,，線粒體，膜系統(tǒng),、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu),、功能的改變。

細(xì)胞衰老原因,，尚無(wú)定論,，出現(xiàn)過(guò)好幾種理論與假說(shuō)，其中得到較廣泛認(rèn)可的是“自由基損傷假說(shuō)”,。

3,、細(xì)胞凋亡:細(xì)胞的死亡是個(gè)體存活的正?，F(xiàn)象，常見的細(xì)胞死亡形式有3種：壞死,、凋亡和細(xì)胞毒性。多細(xì)胞生物的生命活動(dòng)中,，因?yàn)榄h(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵,，導(dǎo)致一部分細(xì)胞死亡，稱為細(xì)胞的病理死亡,，或細(xì)胞壞死,。壞死是細(xì)胞暴露于嚴(yán)重的物理或化學(xué)刺激時(shí)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡；細(xì)胞毒性是由細(xì)胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細(xì)胞殺傷事件,，不依賴于其它兩種細(xì)胞死亡機(jī)理,，如殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

還有一種情況,，一部分細(xì)胞的死亡是生物個(gè)體正常生命活動(dòng)（代謝,、生長(zhǎng)、發(fā)育,、分化）的一個(gè)必要部分,；似乎帶有“犧牲局部，保全整體”的意味,。這種情況下的細(xì)胞死亡,，明顯地受遺傳控制，稱為細(xì)胞凋亡,。 凋亡（Apoptosis）則是程序性的,、正常的細(xì)胞死亡，是機(jī)體清除無(wú)用的或者不想要的細(xì)胞的手段,。它與細(xì)胞壞死是兩個(gè)截然不同的過(guò)程,，無(wú)論從形態(tài)學(xué)、生物學(xué)還是生化的特征來(lái)說(shuō),，都有明顯的區(qū)別,。細(xì)胞凋亡現(xiàn)象普遍存在于生物界。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖,、分化和衰老起著互補(bǔ)與平衡的作用,，在多細(xì)胞動(dòng)物的發(fā)育、形態(tài)建成與維持中扮演至關(guān)重要的角色,。作為細(xì)胞的一種基本生命現(xiàn)象,，凋亡失控的結(jié)果將是可怕的：凋亡不足時(shí)，易發(fā)生癌變,、病毒性疾病和自身免疫疾??；而凋亡過(guò)量則可能產(chǎn)生獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）、重癥肝炎與退行性神經(jīng)疾病,，如老年性癡呆癥（Alzheimer's disease）,、帕金森氏癥（Parkinson's disease）。因此研究細(xì)胞凋亡及其機(jī)理具有重要的理論和實(shí)踐意義,。

細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別

壞死 ：

形態(tài)學(xué)特征-膜完整性喪失,胞漿和線粒體膨脹 ,全細(xì)胞裂解

生化特征-離子內(nèi)環(huán)境失調(diào),非能量依賴性的（被動(dòng)過(guò)程,，在4°C也可以發(fā)生）,隨機(jī)消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀態(tài)）,Postlytic DNA斷裂

生理學(xué)特征-影響群組細(xì)胞 由非生理學(xué)因素引起（如補(bǔ)體攻擊、代謝中毒,、缺氧等）,被巨噬細(xì)胞吞噬, 周圍有明顯的炎癥反應(yīng)

凋亡 ：

形態(tài)學(xué)特征-胞膜出芽,，但保持完整,染色體聚集在核膜周邊,胞漿收縮、細(xì)胞核凝集,zui后細(xì)胞分裂為凋亡小體,Bcl-2家族蛋白導(dǎo)致線粒體膜通透性增加

生化特征--ATP依賴性的（主動(dòng)過(guò)程,，在4°C不能發(fā)生）,以核小體為單位剪切DNA（電泳顯示為DNA ladder）,Prelytic DNA 斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中（細(xì)胞色素c,、AIF）,Caspases級(jí)聯(lián)活化,膜對(duì)稱性改變（PS外翻）

生理學(xué)特征--只影響單個(gè)細(xì)胞 ,由生理學(xué)刺激誘導(dǎo)（如生長(zhǎng)因子缺乏、激素環(huán)境改變等）,被臨近細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬 無(wú)炎癥反應(yīng)