一：液相色譜法概述

　　液相色譜法(HPLC)是上個(gè)世紀(jì)七十年代迅速發(fā)展起來的一項(xiàng),、快速的分析分離技術(shù)，是現(xiàn)代分離測(cè)試的重要手段,。色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相( phase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí),，由于與固定相(station phase)發(fā)生作用(吸附、分配,、排阻、親和)的大小,、強(qiáng)弱不同,，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出,。又稱為色層法,、層析法。

　　HPLC是在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,，其以液體作為流動(dòng)相,，并采用顆粒極細(xì)的固定相的柱色譜分離技術(shù)。其分離機(jī)制與常規(guī)柱色譜相同,，但填料更加精細(xì),，需高壓泵推動(dòng)，柱效高,，分析速度快,。與氣相色譜不同的是液相色譜中流動(dòng)相亦參與組分的分離過程，其組成,、比例和pH值可靈活調(diào)節(jié),，分離模式多樣。在實(shí)際操作中主要通過改變流動(dòng)相的組成來調(diào)節(jié)樣品在色譜柱的保留值和選擇性,，從而使不同樣品得到分離,。

　　液相色譜法自20世紀(jì)60年代問世以來，由于使用了高壓輸液泵,、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測(cè)器,，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的高速、和高靈敏度的分離測(cè)定。液相色譜由于吸取了經(jīng)典液相色譜的研制經(jīng)驗(yàn),，并引入微處理機(jī)技術(shù),，極大的提高了儀器的自動(dòng)化水平和分析精度。現(xiàn)在用微處理機(jī)控制的液相色譜儀,，其自動(dòng)化程度很高,，既能控制儀器的操作參數(shù)(如溶劑梯度洗脫、流動(dòng)相流量,、柱溫,、自動(dòng)進(jìn)樣、洗脫液收集,、檢測(cè)器功能等),，又能對(duì)獲得的色譜圖進(jìn)行收縮、放大,、疊加,，以及對(duì)保留數(shù)據(jù)和峰高、峰面積進(jìn)行處理等,，為色譜分析工作者提供了率,、功能齊全的分析工具。

　　液相色譜法的應(yīng)用范圍十分廣泛,，對(duì)樣品的適用性廣,，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點(diǎn),、極性,、離子型化合物和大分子物質(zhì)均可用液相色譜法分析測(cè)定，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足,。在目前已知的有機(jī)化合物中,，可用氣相色譜分析的約占20% ，而80% 則需用液相色譜來分析,。HPLC因其具有分離效能高,、分析速度快、檢測(cè)靈敏度好,、能分析和分離高沸點(diǎn)且不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質(zhì)的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué),、藥物及臨床分析，世界各國(guó)己將該法收載于藥典,。

　　火焰離子化檢測(cè)器,、手性、化學(xué)發(fā)光,、核磁共振,、質(zhì)譜檢測(cè)器等新型檢測(cè)技術(shù)

　　由于HPLC分析不受溫度和樣品沸點(diǎn)限制，因此具有更廣闊的應(yīng)用潛力。經(jīng)過30多年的迅速發(fā)展,，液相色譜法在基礎(chǔ)理論,、儀器裝置和色譜柱等方面的研究已趨于成熟，現(xiàn)已成為化學(xué)化工,、環(huán)境,、藥學(xué)、食品等多個(gè)領(lǐng)域中具優(yōu)勢(shì)的分離分析方法之一,。

　　二：基本原理

　　液相色譜根據(jù)分離機(jī)理的不同可分為：

　　¬液固吸附色譜

　　¬液液分配色譜

　　¬離子交換色譜

　　¬離子對(duì)色譜法

　　¬分子排阻色譜(或凝膠滲透色譜)

　　(一)液-固吸附色譜

　　流動(dòng)相為液體,，固定相為固體吸附劑，根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來分離物質(zhì),。

　　(二)液-液分配色譜

　　流動(dòng)相和固定相都是液體的色譜法即為液-液色譜,，是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間的分配來進(jìn)行分離。一種液相為流動(dòng)相,，另一種是涂于載體上的固定相,。

　　流動(dòng)相極性小于固定相極性的液-液色譜法稱為正相分配色譜法。

　　流動(dòng)相極性大于固定相極性的液-液色譜法稱為反相分配色譜法,。

　　(三)離子交換色譜

　　(四)離子對(duì)色譜法

　　(五)分子排阻色譜法

　　三：常見故障和維護(hù)

　　3.1 HPLC對(duì)流動(dòng)相的一般要求

　　流動(dòng)相就比如人體的血液,，其質(zhì)量直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的正常運(yùn)行與否。

　　應(yīng)該使用HPLC級(jí)的溶劑,，不能互相混溶的溶劑不可以直接切換!一般在水相和與其不混溶的溶劑切換時(shí),，使用異丙醇作為過渡溶劑,。

　　注意溶劑的截止波長(zhǎng),。截止波長(zhǎng)是指該溶劑可以在紫外檢測(cè)器中使用的低波長(zhǎng)，低于該波長(zhǎng)后,，溶劑會(huì)有很強(qiáng)的紫外吸收,，從而影響極限的穩(wěn)定性、干擾對(duì)所分析物質(zhì)的檢測(cè),。

　　HPLC所使用的水必須是新鮮的和經(jīng)過0.45μm濾膜過濾過的,。建議每天更換新鮮的水。長(zhǎng)期不用時(shí),，必須把使用水的管路用有機(jī)溶劑置換,，防止長(zhǎng)霉。

　　儀器使用完后要采用適當(dāng)?shù)娜軇_洗等方法維護(hù)色譜柱和系統(tǒng),。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈,。

　　儀器長(zhǎng)期不用時(shí)，不建議使用純乙腈封存,。因?yàn)橐译嬗猩删酆衔锏内厔?shì),。建議使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。

　　當(dāng)有流路堵塞時(shí),，可以嘗試將之反接后沖洗,。污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長(zhǎng)將會(huì)縮短溶劑過濾器的使用壽命，并且影響泵和系統(tǒng)的的性能,。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH 4 至7) 中尤其如此,。

　　3.1.1 過濾器

　　•檢查溶劑過濾器

　　查看過濾器是否變色(尤其是盛放水相的溶劑瓶)–擰開脫氣機(jī)出口或比例閥入口管線，此時(shí)溶劑會(huì)因?yàn)橹亓α鞒?。?dāng)脫氣機(jī)或溶劑過濾頭堵塞時(shí),，溶劑會(huì)流出不暢或不流出–臨時(shí)取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常,。

　　•清潔溶劑過濾器

　　將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下,，用水沖洗殘留之溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸(35%左右)的燒杯里浸一小時(shí),。用二次蒸餾水*沖洗過濾器至水為中性可以把過濾器放在塑料燒杯內(nèi)超聲清洗,。但是不可使用玻璃器皿將過濾器重新裝好。

　　•建議：定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶(可以高溫滅菌),，每三個(gè)月至少清洗一次,。

　　3.1.2 泵的使用要點(diǎn)

　　?將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面或較高處。當(dāng)在四元泵上使用鹽溶液或有機(jī)溶劑時(shí),，建議將鹽溶液接在下面的梯度閥口上,，將有機(jī)溶劑接在上面的梯度閥口上，有機(jī)溶劑通道好在水或鹽溶液通道的正上面,。建議用水定期沖洗所有MCGV通道除去可能在閥口析出的鹽結(jié)晶,。

　　?操作泵之前，用至少兩個(gè)體積(標(biāo)準(zhǔn)脫氣機(jī)30mL,，對(duì)微脫氣機(jī)10mL)沖洗真空脫氣機(jī),，特別是當(dāng)泵關(guān)閉了一段時(shí)間后(例如，過夜),，以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時(shí),，防止溶劑瓶?jī)?nèi)的玻璃濾頭(過濾器)堵塞及長(zhǎng)菌，當(dāng)濾頭表面有黑色或黃色污染層說明發(fā)生了堵塞,，應(yīng)立即清洗或更換,。

　　?定期檢查排液閥的過濾白頭。檢查方法：擰開排液閥,，以水作流動(dòng)相,。

　　對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)脫氣機(jī)(G1322A)，流速5ml/min水,，若壓力大于10bar,，則建議更換,。

　　對(duì)于微量脫氣機(jī)(G1379A)，流速2ml/min水,，若壓力大于5bar,，則建議更換。

　　?當(dāng)使用低流速時(shí),，檢查所有1/16英寸接頭有無滲漏(用壓力測(cè)試或漏液測(cè)試,。每當(dāng)更換泵密封墊時(shí)排液閥慮芯也應(yīng)更換。

　　?更換活塞密封墊時(shí)檢查活塞桿上是否有劃痕,。有劃痕的活塞將導(dǎo)致輕度滲漏,，并降低密封墊的使用壽命。應(yīng)盡早更換有劃痕的活塞,。

　　?使用緩沖溶液時(shí),，關(guān)泵前先用水沖洗系統(tǒng)。當(dāng)需要長(zhǎng)時(shí)間使 用0.1摩爾或更高濃度的緩沖液時(shí),，好選用密封墊清洗附件,，以減少對(duì)密封墊及活塞桿的磨損。

　　?如果使用了高濃度的緩沖鹽,，可以考慮用熱水(50-60℃)來沖洗鹽通道來確保沒有緩沖鹽殘留在系統(tǒng)中,。

　　?更換活塞密封墊后應(yīng)按照密封墊安裝步驟對(duì)其進(jìn)行磨合，但磨合不適用于正相密封墊,。

　　?當(dāng)泵頭安裝有柱塞清洗附件時(shí),，由于該附件中也有密封墊，這樣就會(huì)增加活塞桿運(yùn)動(dòng)時(shí)的阻力,。所以開泵前一定要用10%異丙醇,，并將其流速調(diào)至約2-3滴/分鐘使溶液流過沖洗裝置。(對(duì)于二元泵SL,，如果不使用鹽溶液可以不開)10%異丙醇有助于降低水的表面張力,，并有抑菌作用,。不要用其它溶劑代替,。

　　?當(dāng)泵頭安裝有沖洗附件而不開啟10%異丙醇，會(huì)使密封墊及活塞桿的壽命減短(二元泵SL除外),，泵頭如果發(fā)出“吱吱”聲不影響使用和泵的精度如果有必要,，可以改變壓縮因子(compressibility)來達(dá)到更好的效果。

　　3.1.3 自動(dòng)進(jìn)樣器

　　樣品在進(jìn)樣前必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)先處理,，需要經(jīng)過亞微米濾膜的過濾或者離心,，防止樣品中的微小顆粒堵塞管路，好使用流動(dòng)相作為溶劑配制樣品,，所用溶劑應(yīng)該對(duì)樣品有較好的溶解性,。

　　針座是喇叭口朝上暴露在空氣中的,，有時(shí)空氣中的較大灰塵顆粒可能恰好落在針座的流路內(nèi)而引起針座的堵塞,。這時(shí)候可以嘗試卸下針座,，將它接在泵的出口上反沖，一般能解決問題,。

　　如果經(jīng)常使用緩沖溶液,，除了泵頭之外，ALS計(jì)量泵的柱塞及密封圈,，六通閥的轉(zhuǎn)子密封圈和定子密封圈應(yīng)該定期清洗,，防止有鹽的顆粒磨損ALS一定要使用Agilent的樣品瓶及瓶蓋;使用不兼容的或者加工精度差的樣品瓶及瓶蓋會(huì)引起ALS故障率的增加及性能的降低。