現(xiàn)代生物技術(shù)均通過細(xì)胞作為載體來進(jìn)行,，無論是基因治療,、干細(xì)胞,、克隆技術(shù)都在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的,。細(xì)胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境,，用于維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基,，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng),、保存細(xì)胞用的物質(zhì),，就其本意上講為人工模擬體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境,，使細(xì)胞在此環(huán)境中有生長和繁殖的能力。它是提供細(xì)胞營養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的物質(zhì)基礎(chǔ),。細(xì)胞培養(yǎng)基其組成成分主要有：水,、氨基酸、維生素,、碳水化合物,、無機(jī)離子及其他一些入核酸降解物、激素等,。

隨著動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展,，作為細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中zui基本的原料－細(xì)胞培養(yǎng)基的用量也迅速增加，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)科和醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域,，如疫苗生產(chǎn)（人用疫苗如乙腦,、狂犬、甲肝、乙肝,、出血熱,、麻疹等，獸用疫苗如口蹄,、馬立克,、偽狂犬等），基因藥物生產(chǎn)（如EPO,、TPA等）,，臨床用單抗（如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗,、WT3）等,。

*節(jié) 水與平衡鹽溶液

1、培養(yǎng)用水:體外培養(yǎng)的細(xì)胞對水質(zhì)特別敏感,，對水的純度要求較高,。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微,，有時也會影響細(xì)胞的存活和生長,，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水,，可能會含有某些金屬離子,，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應(yīng)使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水,。用瓶貯存,，存放時間一般不應(yīng)超過2周。

2,、緩沖溶液,、生理鹽水、平衡鹽溶液：稍后介紹,。

第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接生活在培養(yǎng)基中,，因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿足細(xì)胞對營養(yǎng)成分、促生長因子,、激素,、滲透壓、pH等諸多方面的要求,。

一,、營養(yǎng)成分 維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)條件一般包括以下幾個方面：

1、氨基酸：是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料,。所有細(xì)胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸,、亮,、異亮、蘇,、賴,、色、苯丙,、蛋,、組、酪,、精氨酸,、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺,，它在細(xì)胞代謝過程中有重要作用,，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三,、二,、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。 體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸,。

2,、單糖：培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源,。此外六碳糖也是合成某些氨基酸,、脂肪,、核酸的原料,。細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力zui高，半乳糖zui低,。

體外培養(yǎng)動物細(xì)胞時,，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。

3,、維生素：主要扮演輔酶,、輔基的角色，*,。生物素,、葉酸、煙酰胺,、泛酸,、吡哆醇、核黃素,、硫胺素,、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分,。

4、無機(jī)離子與微量元素：細(xì)胞生長除需要鈉,、鉀,、鈣、鎂,、氮和磷等基本元素,，還需要微量元素，如鐵,、鋅,、硒、銅,、錳,、鉬、釩等,。

二,、促生長因子及激素 已證實(shí)：各種激素、生長因子對于維持細(xì)胞的功能,、保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用,。有些激素對許多細(xì)胞生長有促生長作用，如胰島素,，它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸,。有些激素對某一類細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，如H-化-可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長,，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長作用等,。

三、滲透壓 細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中,，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性,。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右,。對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞,，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

四,、pH 氣體也是細(xì)胞生存的必需條件之一,，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán),，產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長,、增殖和合成各種成分。一些細(xì)胞在缺氧情況下,，借糖酵解也可獲取能量,，但多數(shù)細(xì)胞缺氧不能生存,。在開放培養(yǎng)時，一般置細(xì)胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng),。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物,，也是細(xì)胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關(guān)系,。動物細(xì)胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件,，pH值約在7．2~7．4℃在細(xì)胞生長過程中，隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強(qiáng),，二氧化碳不斷被釋放,，培養(yǎng)液變酸，PH值發(fā)生變化,。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳,，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以地控制,。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng),。HEPES結(jié)合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩沖體系,，主要是防止pH值迅速變動,，但zui大缺點(diǎn)是在開放培養(yǎng)或觀察時難以維持正常的pH值。造成pH波動主要是代謝產(chǎn)生的CO2,，在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸,，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題,，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng),，并采用開放培養(yǎng)，使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2及時溢出培養(yǎng)瓶,，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5％）,，與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài),。

五,、無毒、無污染 體外生長的細(xì)胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力,，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無化學(xué)物質(zhì)污染,、無微生物污染（如細(xì)菌、真菌,、支原體,、病毒等）、無其他對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體,、補(bǔ)體）,。對于天然培養(yǎng)基,，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材,，嚴(yán)格操作,。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程,，配制所用的水,，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌,。 

第三節(jié) 天然細(xì)胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基,，如血漿、血清,、淋巴液,、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期,，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基,。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大,，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代,。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液,、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是*,。

一、血清(serum)細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展,，培養(yǎng)基的質(zhì)量又是關(guān)鍵,，而培養(yǎng)基的主要成份中動物血清對細(xì)胞的生長繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應(yīng)用中牛血清又是的,，所以血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一,。保證血清質(zhì)量也是促進(jìn)生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié)。

1,、血清種類:目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清,，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等,。選擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因：來源充足,、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過長時間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對其有比較深入的理解,。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞都是適合的,，但并不排除在培養(yǎng)某種細(xì)胞時使用其他動物血清更合適。

牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量zui大的天然培養(yǎng)基,，含有豐富的細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成份,，具有極為重要的功能,。牛血清分為小牛血清、新牛血清,、胎牛血清,。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛,；小牛血清取自出生10－30天的小牛,。顯然，胎牛血清是品質(zhì)zui高的,，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界,，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對細(xì)胞有害的成分zui少,。

2,、血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已知,，但還有一部分尚不清楚,，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡,、生理?xiàng)l件和營養(yǎng)條件不同而異,。血清中含有各種血漿蛋白、多肽,、脂肪,、碳水化合物、生長因子,、激素,、無機(jī)物等，這些物質(zhì)對促進(jìn)細(xì)胞生長或抑制生長活性是達(dá)到生理平衡的,。對血清的成分和作用的研究雖有很大進(jìn)展,，但仍存在一些問題。主要是：

*:血清的成份可能有幾百種之多,，目前對其準(zhǔn)確的成份,、含量及其作用機(jī)制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子,、激素和脂類等尚未充分認(rèn)識,，這給研究工作帶來許多困難,；

第二:血清都是批量生產(chǎn),，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年,，因此,，要保證每批血清的相似性極為困難,，從而使實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制；

第三:不能排除血清中含有易變物質(zhì),，這被認(rèn)為是“瓶中惡化”的原因之一,。

3、血清主要作用：

提供基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸,、維生素,、無機(jī)物、脂類物質(zhì),、核酸衍生物等,，是細(xì)胞生長必須的物質(zhì)。

提供激素和各種生長因子：胰島素,、腎上腺皮質(zhì)激素（H-化-可-的松,、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇,、睪酮,、孕酮）等。生長因子如成纖維細(xì)胞生長因子,、表皮生長因子,、血小板生長因子等。

提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì),，如白蛋白攜帶維生素,、脂肪、以及激素等,，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵,。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起重要作用。

提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷,。

對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：有一些細(xì)胞,，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶,，血清中含有抗蛋白酶成分,，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的,，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用,。因?yàn)橐鹊鞍酌敢呀?jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度,，可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷,，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子,，他們在代謝解毒中起重要作用,，如SeO3,硒等。

4,、細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)

血清成分復(fù)雜,，雖含許多對細(xì)胞有利成分，也含有對細(xì)胞有害的成分,，使血清有幾個明顯的缺點(diǎn)：

對大多數(shù)細(xì)胞,，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體,，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清,，因此使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長（成纖維細(xì)胞）同時抑制另一類細(xì)胞生長（表皮細(xì)胞）,。

血清含一些對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì),，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)（如精胺,、亞精胺）形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺,。補(bǔ)體、抗體,、細(xì)菌毒素等都會影響細(xì)胞生長,，甚至造成細(xì)胞死亡。

動物個體不同,，血清產(chǎn)地,、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大,，其成分不能保持一致,。

取材中可能帶入支原體、病毒,，對細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響,，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不可靠性。

血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難,，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成,。

大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難,，價格昂貴,，是構(gòu)成動物細(xì)胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。 

5,、血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對象,，二是取材過程。用于取材的動物應(yīng)健康無病并且在的出生天數(shù)之內(nèi)，取材過程應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行,，制備出的血清要經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定,。WHO公布的《用動物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求：

牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家,。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng),。

有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物,。

血清要通過濾膜過濾除菌,，保證無菌。

無細(xì)菌,、霉菌,、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細(xì)菌噬菌體污染,。

對細(xì)胞有良好的支持繁殖作用,。

我國在對牛血清的質(zhì)量2000年版《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包括蛋白質(zhì)含量,，細(xì)菌,、真菌、支原體,、牛病毒,、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素,，支持細(xì)胞增殖檢查,。

血清質(zhì)量的鑒定一般包括以下幾個方面：

理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值,、蛋白電泳圖譜,、蛋白含量、激素水平,、內(nèi)毒素等,。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20g/L),、血紅蛋白含量等,。其中球蛋白含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體,，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高,。血紅蛋白也是越低越好。

微生物檢測：包括細(xì)菌,、真菌,、支原體、病毒等。特別是對支原體,、病毒的檢測,，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜,。支原體,、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺，細(xì)胞也能生長繁殖,，但會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法,、PCR法,、熒光染色法、電鏡觀察法等,。

促生長效果：這是血清重要的特性之一,，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測。有兩種方法：克隆形成率,、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法,。

(1)克隆形成率測定:一般以懸浮生長的細(xì)胞為培養(yǎng)對象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng),，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基,，細(xì)胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板,，每孔200ul,，培養(yǎng)一定時間，統(tǒng)計(jì)有克隆生長的孔,，計(jì)算出百分比,，再與對照的標(biāo)準(zhǔn)血清相比較，就可看出不同批號血清間的區(qū)別,。比較低的濃度,，更能觀察出血清質(zhì)量間的細(xì)微差別。

(2)貼瓶率測定:是以貼壁細(xì)胞為培養(yǎng)對象,，將細(xì)胞稀釋至低密度,，接種至平皿，每皿200或100個細(xì)胞,，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng),，培養(yǎng)一定時間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計(jì)集落數(shù),，計(jì)算出集落數(shù)占接種細(xì)胞數(shù)的百分比,，同樣再與標(biāo)準(zhǔn)血清比較,，判斷血清質(zhì)量高低。

(3)連續(xù)傳代培養(yǎng)法:是將細(xì)胞培養(yǎng)于3個一定體積的培養(yǎng)瓶中,，待測血清配制為5％濃度,，一般于第七天收集細(xì)胞，計(jì)數(shù),，取平均值,，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測試三個周期以上,，觀察細(xì)胞生長狀況,，并將每次的計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)血清的測試結(jié)果比較,。

對于使用者,，判斷血清質(zhì)量先從外觀入手。好的血清應(yīng)該是透明清亮,，土黃色或棕黃色,，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠,。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁,、不透明、含許多沉淀物,，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性,；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高,，取材時有溶血現(xiàn)象,；如果搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多,。如果要進(jìn)一步了解血清的質(zhì)量,，則應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)某些細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長狀況,。

6,、血清的使用與儲存:正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應(yīng)有的作用,。

使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理,，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分,，避免補(bǔ)體對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,。血清經(jīng)過滅活也會損失一些對細(xì)胞有利的成分，如生長因子,，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng),，這樣做的前提是確認(rèn)血清中不含補(bǔ)體成分,。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。

儲存條件：血清一般儲存于－20℃,，同時應(yīng)避免反復(fù)凍融,。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理,，然后分裝成小包裝,，儲存于－20℃，使用前融化,。融化時現(xiàn)置于4℃,。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應(yīng)盡快使用,。

使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基,，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5－20％,，zui常用是10％,。過多血清容易使培養(yǎng)中的細(xì)胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無限細(xì)胞系,，迅速生長之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,。 采購血清時，先從供應(yīng)商處索取樣品進(jìn)行試驗(yàn),，選定一批后就要保留足夠使用6個月至1年的量,，直至用另一批經(jīng)過預(yù)先試驗(yàn)的樣品代替。

二,、胚胎浸出液

胚胎浸出液(embryonic extract)是早期動物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的天然培養(yǎng)基,，現(xiàn)已很少使用。

三,、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物,，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基,，可用于許多細(xì)胞和原代細(xì)胞的培養(yǎng),。