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免疫組化非特異性染色及控制方法

來(lái)源:武漢基因美生物科技有限公司   2011年03月02日 11:54  

                                                          免疫組化非特異性染色及控制方法

一,、非特異性染色的識(shí)別

常出現(xiàn)在組織邊緣、膠原纖維及血漿滲出處,,壞死組織及固定不良的組織中心處,。表現(xiàn)為彌漫性,均勻性的背景染色,。也可以是隨機(jī)分布的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn),、團(tuán)或塊狀。

二,、非特異性染色的原因

1. Ig與Fc受體結(jié)合

多見(jiàn)于冰凍切片(特別是淋巴造血組織,,淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞,,組織細(xì)胞表面多),,主要是和二抗反應(yīng),因?yàn)橐豢挂话阆♂尪染^大,,因此Fc受體的干擾基本不存在,。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體,所以石蠟切片不多見(jiàn),。

避免方法

(1)用以二抗相同種族的正常血清封閉切片;

(2)用不含F(xiàn)c段的抗體,,但價(jià)格貴,。(V區(qū),C1區(qū)不含F(xiàn)c段,,用Pepsin消化)

2. 靜電吸附

抗體是一種帶負(fù)電荷的球蛋白,,容易和帶正電荷的組織相結(jié)合,如膠原纖維,。

避免方法

(1)盡量稀釋一抗,;

(2)降低抗體的電荷,如用2.5%NaCl,,0.05mTBS代替PBS,;

(3)用去垢劑如triton-100,Tween-20等處理切片。

3. 二抗與組織中的Ig結(jié)合

如羊抗兔的二抗,,二抗可以標(biāo)本中(人)Ig發(fā)生交叉反應(yīng),,科學(xué)上越接近的動(dòng)物,交叉反應(yīng)越明顯,,如人與猴,,兔與豚鼠。

避免方法:用與待測(cè)組織相同的5%的正常血清稀釋二抗,。如人血清,。

4. 組織中殘存醛基與Ig的結(jié)合

如醛類固定后未能*的沖洗,殘留醛基可以和Ig結(jié)合,。

避免方法

(1)*沖洗,;

(2)0.02%的新鮮的硼氧化鉀液處理10分鐘后沖洗。

一,、非特異性染色的識(shí)別
常出現(xiàn)在組織邊緣,、膠原纖維及血漿滲出處,壞死組織及固定不良的組織中心處,。表現(xiàn)為彌漫性,,均勻性的背景染色。也可以是隨機(jī)分布的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn),、團(tuán)或塊狀,。
二、非特異性染色的原因
1. Ig與Fc受體結(jié)合
多見(jiàn)于冰凍切片(特別是淋巴造血組織,,淋巴細(xì)胞,,單核細(xì)胞,組織細(xì)胞表面多),,主要是和二抗反應(yīng),,因?yàn)橐豢挂话阆♂尪染^大,因此Fc受體的干擾基本不存在,。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體,,所以石蠟切片不多見(jiàn)。
避免方法:
(1)用以二抗相同種族的正常血清封閉切片,;
(2)用不含F(xiàn)c段的抗體,,但價(jià)格貴。(V區(qū),,C1區(qū)不含F(xiàn)c段,,用Pepsin消化)
2. 靜電吸附
抗體是一種帶負(fù)電荷的球蛋白,容易和帶正電荷的組織相結(jié)合,,如膠原纖維,。
避免方法:
(1)盡量稀釋一抗,;
(2)降低抗體的電荷,如用2.5%NaCl,,0.05mTBS代替PBS,;
(3)用去垢劑如triton-100,Tween-20等處理切片,。
3. 二抗與組織中的Ig結(jié)合
羊抗兔的二抗,,二抗可以標(biāo)本中(人)Ig發(fā)生交叉反應(yīng),科學(xué)上越接近的動(dòng)物,,交叉反應(yīng)越明顯,,如人與猴,兔與豚鼠,。
避免方法:用與待測(cè)組織相同的5%的正常血清稀釋二抗,。如人血清。
4. 組織中殘存醛基與Ig的結(jié)合
如醛類固定后未能*的沖洗,,殘留醛基可以和Ig結(jié)合,。
避免方法:
(1)*沖洗;
(2)0.02%的新鮮的硼氧化鉀液處理10分鐘后沖洗,。
 
5. 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶
紅細(xì)胞,,粒細(xì)胞的含量尤其高,鏡下可以識(shí)別,,不要將其當(dāng)成陽(yáng)性結(jié)果,。
避免方法:
(1)石蠟切片 0.3%雙氧水-甲醇溶液處理切片;
(2)冰凍切片 3%雙氧水處理切片5分鐘(99:1)因?yàn)槲唇?jīng)固定包埋,,大部分酶未被破壞,;
(3)對(duì)于骨髓涂片 用非過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體
6. 內(nèi)源性生物素
以 24mg/ml的卵白素封片15分鐘。
7. 交叉反應(yīng)
PcAb敏感性高,,但特異性稍低,,容易出現(xiàn)非特異性染色。
避免方法:
(1)盡可能稀釋抗體,;
(2)盡可能用McAb,。
 
 

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