要先對PCR目的序列的長度有個大致估計：

*步：找到Primer3的站點,。你不用記住這個站點,，但是要記住“Primer3”這個詞,，然后打開GOOGLE首頁,，輸入Primer3,，跳出來的*個項目就是了“Primer3 Input 0.4.0 （primer3-web/htdocs/input-040.htm）”是http://frodo.wi.mit.edu/,。

第二步：貼上模板序列,。進入Primer3站點,，可以看到一個引物設(shè)計的界面,。（附件Word文檔里有圖）在“Paste source sequence below （5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖進去。注意是5'->3'方向的,，數(shù)字或者空格都沒關(guān)系,，軟件會自動過濾的。

第三步：重要參數(shù)設(shè)定,。首先是“Product Size Ranges”,，如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調(diào)整的就是這個參數(shù),。默認的參數(shù)實際上是從100到1000,，這個你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預期,，盡可能把范圍改小,，比如480-500,，具體看情況調(diào)整。第二個參數(shù)是“Primer Size”,，默認值一般可以用,，但是，當你用熟了這個軟件,，你自己就知道該怎么改了,。第三個參數(shù)是”Primer Tm”這個和Primer Size差不多。

第四步：Pick primers： 點一下這個按鈕,，符合你大小預期的primer就出來了,，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮,！你要的primer出來了,，而且有primer在序列上的位置比對圖，還要primer本身的信息,，包括位置,，長度，Tm,，GC含量,，任何位置互補堿基數(shù)，3'端互補堿基數(shù),，以及引物序列,，（注意，下游引物是5'->3'）,，還要產(chǎn)物大小,，兩引物間任意互補堿基數(shù)，兩引物間3'端互補堿基數(shù)等,。如果引物尚在參數(shù)設(shè)定的范圍內(nèi),，但還不是*，將會給出警告,。

第五步：引物設(shè)計檢驗：可以僅僅設(shè)計一向引物,，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一個就可以。也可以自己定義引物,，放在Primer框里,，（注意，下游引物的書寫反向仍然是5'->3'）如果符合設(shè)定的條件,，軟件將對給出引物評分,，同時給出警告信息，根據(jù)警告信息可以適當對自定義引物做些調(diào)整即可,，警告信息也讓你做實驗的時候心中有數(shù),。對于文獻發(fā)表的引物，都要檢查一下,，這樣就可以避免被別人有意無意誤導,。至于RT-PCR所用的引物，是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子,，這樣避免潛在DNA對RT-PCR的干擾,。實際做引物的時候，要把內(nèi)含子都去掉,，僅僅把外顯子序列放入源序列框中,，并且通過自定義引物設(shè)計的方法，使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上,。至于如何快速識別內(nèi)含子和外顯子以及電子PCR,，我將抽空另做說明。

至于設(shè)計出來的引物的實際效果,，根據(jù)我的經(jīng)驗,，一般情況下都能做到PCR一次成功，也許隨便那一段序列做引物也能達到很好的效果,，但是不管怎么說,，軟件做引物可以讓自己心中有數(shù)。zui后,，GOOD LUCK TO EVERYONE.