免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique) 是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，英文縮寫為：GICT,。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷,、抗壞血酸、枸櫞酸鈉,、鞣酸等作用下,，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài),，稱為膠體金,。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合,，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合,，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。 膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外,，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合,，如SPA、PHA,、ConA等,。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度,、顆粒大小,、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性,，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué),、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域,。

使用優(yōu)點(diǎn)

(1)使用方便快速,，便于基層使用和現(xiàn)場(chǎng)使用，所有反應(yīng)能在15分鐘內(nèi)完成,；

(2)成本低,，不需要特殊的儀器設(shè)備；

(3)應(yīng)用范圍廣，可適應(yīng)多種檢測(cè)條件,；

(4)可以進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè),，若陽性樣本比較難獲得，多項(xiàng)檢測(cè)可以節(jié)省樣品,，降低成本,；

(5)標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記樣品在4℃貯存兩年年以上,，無信號(hào)衰減現(xiàn)象,；

(6)膠體金本身為紅色，不需要加入發(fā)色試劑,，省卻了酶標(biāo)的致癌性底物及終止液的步驟,，對(duì)人體無毒害。

顆粒制備

根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒,。常用來制備膠體金顆粒的方法如下,。

1．枸櫞酸三鈉還原法

（1）10nm膠體金粒的制備：取0.01%HAuCl4水溶液100ml，加入1%枸櫞酸三鈉水溶液3ml,，加熱煮沸30min,，冷卻至4℃，溶液呈紅色,。

（2）15nm膠體金顆粒的制備：取0.01%HAuCl4水溶液100ml,，加入1%枸櫞酸三鈉水溶液2ml,，加熱煮沸15min～30min,，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml,，混勻即可,。

（3）15nm、18nm～20nm,、30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01%HAuCl4水溶液100ml,，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1%枸櫞酸三鈉水溶液4ml,、2.5ml,、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min,，出現(xiàn)橙紅色,。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、18～20nm,、30nm和50nm,。

2．鞣酸—枸櫞酸鈉還原法

A液：1%HAuCl4水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。

B液：1%枸櫞酸三鈉4ml，1%鞣酸0.7ml,，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml,，混合，加入雙餾水至20ml,。

將A液,、B液分別加熱至60℃，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中,，溶液變藍(lán),，繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm,。

3．制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)

（1）玻璃器皿必須*清洗,，是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用*次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿,，再用雙餾水沖洗后使用,。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒,。

（2）試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈,，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45mm）過濾,，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì),。

（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。

（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘,，雜質(zhì)少,。是進(jìn)口的。

（5）氯金酸配成1%水溶液在4℃可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定,，由于氯金酸易潮解,，因此在配制時(shí)，將整個(gè)小包裝一次性溶解,。

蛋白制備

膠體金對(duì)蛋白的吸附主要取決于pH值,，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物,。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí),，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小,、離子強(qiáng)度,、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

1．待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜,，以除去多余的鹽離子,，然后100 000g4℃離心1h,，去除聚合物。

2．待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值,。標(biāo)記IgG時(shí),，調(diào)至9.0；標(biāo)記McAb時(shí),調(diào)至8.2,；標(biāo)記親和層析抗體時(shí),，調(diào)至7.6；標(biāo)記SPA時(shí),，調(diào)至5.9～6.2,；標(biāo)記ConA時(shí)，調(diào)至8.0,；標(biāo)記親和素時(shí),，調(diào)至9～10。

由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板,，因此,，在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測(cè)定為宜,。

3．膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定

（1）根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求,，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管,，每管1ml,。

（2）將標(biāo)記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5mg/ml～50mg/ml，分別取1ml,，加入上列金膠溶液中,，混勻。對(duì)照管只加1ml稀釋液,。

（3）5min后,，在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液,，混勻后靜置2h,，觀察結(jié)果。

（4）結(jié)果觀察,，對(duì)照管（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管,，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達(dá)到或超過zui低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變,。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的zui低蛋白質(zhì)用量,，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的zui低用量，在實(shí)際工作中,，可適當(dāng)增加10%～20%,。

4．膠體金與蛋白質(zhì)（IgG）的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液,，繼續(xù)攪拌10min,，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5%胎牛血清（BSA）和1%聚乙二醇（分子量20KD）,。加入的量：5%BSA使溶液終濃度為1%,；1%聚乙二醇加至總?cè)芤旱?/10。

5．膠體金標(biāo)記蛋白的純化

（1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小,，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間,。

用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金—羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min）20min,，棄去凝聚的沉淀,。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g，4℃離心1h,；20nm～40nm膠體金結(jié)合物,，14 000g，4℃離心1h,。仔細(xì)吸出上清,，沉淀物用含1%BSA的PB液（含0.02%NaN3），將沉淀重懸為原體積的1/10,，4℃保存,。如在結(jié)合物內(nèi)加50%甘油可貯存于-18℃保存一年以上。

為了得到顆粒均一的免疫金試劑,，可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用10%～30%蔗糖或甘油進(jìn)行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物,。

（2）凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋,，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1/5～1/10,。再經(jīng)1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠S-400）層析柱分別純化,。層析柱為0.8 cm×20cm,，加樣量為床體積的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脫（內(nèi)含0.1%BSA,，0.05%NaN3,，pH8.2者用IgG標(biāo)記物），流速為8ml/h,。按紅色深淺分管收集洗脫液,。一般先濾出的液體為微黃色，有時(shí)略混濁,，內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì),。繼之為純化的膠體金蛋白結(jié)合物,，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明,，zui后洗脫出略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分,。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過濾除菌、分裝,4℃保存,。zui終可得到70%～80%的產(chǎn)量,。

6．膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定

（1）膠體金顆粒平均直徑的測(cè)量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標(biāo)蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察,?；蛴么姿徕檹?fù)染后觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑,。

（2）膠體金溶液的OD520nm值測(cè)定：膠體金顆粒在波長(zhǎng)510nm～550nm之間出現(xiàn)zui大吸收值峰,。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1%BSA，0.02%NaN3）將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋,，OD520=0.25左右,。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.2～0.4。

（3）金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測(cè)定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MF－IGSSA）,。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙,、硝酸纖維膜、微孔濾膜）,，用膠體金標(biāo)記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體,，對(duì)金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。

組成結(jié)構(gòu)

膠體金作為免疫標(biāo)記物始于1971年,，由Faulk和Taylor將其引入免疫化學(xué),。Faulk 和Taylor首先將兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用直接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌的表面抗原,。此后,，他們還把膠體金與抗膠原血清，植物血凝素,，卵白蛋白,，人免疫球蛋白輕鏈、牛血清白蛋白結(jié)合應(yīng)用,。1974年Romano和他的同事們將膠體金標(biāo)記在馬抗人的IgG上,，實(shí)現(xiàn)了間接免疫金染色法,。層析法檢測(cè)試劑zui早出現(xiàn)于1988年,，是Unipath公司利用染料顆粒開發(fā)生產(chǎn)的一種非常方便使用的懷孕檢測(cè)試劑。1989年,，Spielberg F等發(fā)展了以膠體金為標(biāo)記物用于檢測(cè)艾滋病毒抗體的滲濾法檢測(cè)試劑,，此后,，免疫膠體金在快速檢測(cè)試劑中得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展，相伴隨的層析法檢測(cè)試劑在組成結(jié)構(gòu),、生產(chǎn)用的材料等方面也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,。

目前市場(chǎng)上見到的典型的層析法檢測(cè)試劑的組成成份可分為三個(gè)部分，其一是多孔材料,，包括樣品墊,、吸水墊、結(jié)合墊及硝酸纖維膜,；其二是試劑,，如抗體、金標(biāo)結(jié)合物等,；其三是層壓結(jié)構(gòu)及卡盒,，如PVC板、雙面膠,、盒等（見表1及圖1）,。

表1 層析法免疫膠體金檢測(cè)試劑的組成成分

圖1 層析法免疫膠體金檢測(cè)試劑結(jié)構(gòu)示意圖

層析法檢測(cè)試劑的各組分，并非簡(jiǎn)單的相互疊加,，改變其中的任一組分,，都可能引起產(chǎn)品整體性能的變化。以zui常見的早早孕檢測(cè)試劑為例,，影響其產(chǎn)品敏感度的因素可能有：

*硝酸纖維膜的特性,，主要反應(yīng)在其流速上。

*膠體金顆粒的大小,，濃度等

*結(jié)合墊的性能,，金標(biāo)結(jié)合物的量

*樣品墊的特性

*檢測(cè)線的位置及寬度

*硝酸纖維膜和結(jié)合墊的疊壓強(qiáng)度

*捕獲抗體的親合力

*檢測(cè)線包被捕獲抗體的量

*結(jié)合抗體的特性

測(cè)試原理

層析法免疫膠體金檢測(cè)試劑實(shí)際上是免疫金標(biāo)記技術(shù)和抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合而形成的一種應(yīng)用形式，相比ELISA試劑,，除標(biāo)記物不同外,，同樣服從于抗原抗體反應(yīng)的特性。此種檢測(cè)方法具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：

*方便使用,，體現(xiàn)在操作簡(jiǎn)單,，不需經(jīng)過特殊培訓(xùn)。

*短時(shí)間獲得檢測(cè)結(jié)果,，一般10－15分鐘即可得出結(jié)論,。

*不同環(huán)境下的穩(wěn)定性好，不需冷藏,。

*相比而言,，其生產(chǎn)成本和檢測(cè)成本均較低。

*檢測(cè)標(biāo)本種類多：可用于查血,、尿液或糞便,，因而適合各種檢查

應(yīng)用

膠體金標(biāo)記技術(shù)由于標(biāo)記物的制備簡(jiǎn)便,，方法敏感、特異,，不需要使用放射性同位素,，或有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物，也不要熒光顯微鏡,，它的應(yīng)用范圍廣,，除應(yīng)用于光鏡或電鏡的免疫組化法外，更廣泛地應(yīng)用于各種液相免疫測(cè)定和固相免疫分析以及流式細(xì)胞術(shù)等,。

1．液相免疫測(cè)定：將膠體金與抗體結(jié)合,，建立微量凝集試驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)的抗原，如間接血凝一樣,，用肉眼可直接觀察到凝集顆粒,。利用免疫學(xué)反應(yīng)時(shí)金顆粒凝聚導(dǎo)致顏色減退的原理，建立均相溶膠顆粒免疫測(cè)定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地應(yīng)用于PCG的檢測(cè),，直接應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析,。

2．金標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)：膠體金可以明顯改變紅色激光的散射角，利用膠體金標(biāo)記的羊抗鼠Ig抗體應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù),，分析不同類型細(xì)胞的表面抗原,，結(jié)果膠體金標(biāo)記的細(xì)胞在波長(zhǎng)632nm時(shí)，90度散射角可放大10倍以上,，同時(shí)不影響細(xì)胞活性,。而且與熒光素共同標(biāo)記，彼此互不干擾,。

3．膠體金固相免疫測(cè)定法

（1）斑點(diǎn)免疫金銀染色法（Dot－IGS/IGSS）是將斑點(diǎn)ELISA與免疫膠體金結(jié)合起來的一種方法,。將蛋白質(zhì)抗原直接點(diǎn)樣在硝酸纖維膜上，與特異性抗體反應(yīng)后,，再滴加膠體金標(biāo)記的第二抗體,，結(jié)果在抗原抗體反應(yīng)處發(fā)生金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn),，此稱為斑點(diǎn)免疫金染色法（Dot－IGS）,。此反應(yīng)可通過銀顯影液增強(qiáng)，即斑點(diǎn)金銀染色法（Dot－IGS/IGSS）,。

（2）斑點(diǎn)金免疫滲濾測(cè)定法（dot immuno－gold filtration assay,DIGFA）此法原理*同斑點(diǎn)免疫金染色法,，只是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強(qiáng)的墊料，即為滲濾裝置,。在加抗原（抗體）后,，迅速加抗體（抗原），再加金標(biāo)記第二抗體，由于有滲濾裝置,，反應(yīng)很快,，在數(shù)分鐘內(nèi)即可顯出顏色反應(yīng),。此方法已成功地應(yīng)用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測(cè),。