RT Primer的佳選擇

通常RT primer可分為三類：oligo dT,，隨機(jī)引物以及基因特異性引物,。Oligo dT引物之所以應(yīng)用范圍更加廣泛,，是因?yàn)榭捎纱双@得mRNA的全長(zhǎng)拷貝,。

然而如果mRNA長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)>4kb,，或者沒(méi)有polyA尾（原核mRNA或rRNA）,，就需要考慮使用隨機(jī)引物進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄,。隨機(jī)引物雖能長(zhǎng)基因的5’末端的轉(zhuǎn)錄,，但并不能獲得整個(gè)基因全長(zhǎng)的cDNAs,，且對(duì)RNA樣品質(zhì)量要求比較高，此時(shí)可用6-8個(gè)核酸聚合體來(lái)提高cDNAs的合成量,。

而對(duì)于真核生物的qPCR,，長(zhǎng)隨機(jī)引物和Oligo-dT引物的混合物似乎能給出一個(gè)漂亮的結(jié)果。針對(duì)此類優(yōu)化混合引物,，已有兩家公司的試劑盒或可助大家一臂之力：Qiagen QuantiTect Rev. Transcription Kit和BioRad iScript Kit,。

第三個(gè)選擇就是基因特異性引物，僅擴(kuò)增需要的cDNA,，適用于目的序列已知的情況,。通常在一步RT-PCR法中可使用此類引物，因?yàn)樵撘镆部捎米鳛镻CR中的反向引物,。

RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

若要獲取全長(zhǎng)RNA的反轉(zhuǎn)錄,，那么RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的問(wèn)題就不可忽略，因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄酶在遇到此類結(jié)構(gòu)后會(huì)終止反應(yīng)或從模板上脫落下來(lái),。

也許你很難判斷RNA是否具有二級(jí)結(jié)構(gòu),，但如果基因中GC含量較高，通常意味著RNA很難被變性且不可能是單鏈,，此時(shí)就需要在65℃ 5min對(duì)其進(jìn)行充分變性,，以避免其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

另外,，還有一種方法可解決此問(wèn)題,，即使用一種適溫度高于正常標(biāo)準(zhǔn)（37℃-42℃）的逆轉(zhuǎn)錄酶,。比如來(lái)自Life Technologies的Themoscript酶就常用于具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)RNA的逆轉(zhuǎn)錄。當(dāng)然也存在一些即使在常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄溫度（37℃-42℃）的條件下,，也能跨過(guò)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的率逆轉(zhuǎn)錄酶,，即使是針對(duì)富集GC序列的RNA也能得到很好的結(jié)果，如Qiagen公司的逆轉(zhuǎn)錄酶Omniscript和Sensiscript,，以及Takara Bio公司的PrimeScirpt RT enzyme,。

去除gDNA

RNA中存在的基因組DNA（gDNA）污染可能是終PCR反應(yīng)中假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的原因，目前已存在很多方法去除gDNA,，比如通過(guò)DNAase對(duì)提取的RNA進(jìn)行預(yù)處理,。

以上方法無(wú)可避免會(huì)造成RNA的蛋白污染，因而這里介紹一種可繞開(kāi)酶處理的方法,，即針對(duì)RNA設(shè)計(jì)一種包含內(nèi)含子或內(nèi)含子-外顯子邊界的引物,，如此DNA就不會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增抑或即便擴(kuò)增了其條帶大小也與cDNA不同。

但值得注意的是,，使用該方法時(shí)基因中要沒(méi)有假基因存在,，假基因（pseudogene）是插入到基因組中剪切mRNA的DNA拷貝，否則也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果,。

而對(duì)于沒(méi)有內(nèi)含子的原核RNA,，gDNA的去除則更是基因表達(dá)準(zhǔn)確測(cè)量的一個(gè)至關(guān)重要的因素。使用DNAase處理RNA是*的方法,，Quantitect Rev.Transcription Kit中所包含的gDNA清除緩沖液就可在無(wú)需加熱或EDTA失活的條件下降解DNA,。此外，具有g(shù)DNA Eraser（Takara Bio）的PrimeScript RT試劑盒也可去除gDNA,，且能在不到20分鐘之內(nèi)快速完成RNA的cDNA合成,。

檢測(cè)RNA分子的完整性

毫無(wú)疑問(wèn)，RNA質(zhì)量對(duì)cDNA合成結(jié)果會(huì)產(chǎn)生重要的影響,，而不同批次間RNA質(zhì)量差異也導(dǎo)致RT-PCR產(chǎn)生不同的結(jié)果,。所以在進(jìn)行RT-PCR前，應(yīng)該檢查RNA條帶的質(zhì)量,，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),。通常完整的真核RNA應(yīng)包括28S和18S RNA條帶，且較大的條帶的強(qiáng)度應(yīng)是較小條帶的兩倍左右,，另外兩個(gè)條帶強(qiáng)度大致相同也是可以的,。

而另一種準(zhǔn)確測(cè)量RNA質(zhì)量的方法是使用Agilent BioAnalzyer儀器，它可將RNA分子可視化并能在分析RNA完整數(shù)值（RNA Integrity Number,，RIN）后給出一個(gè)質(zhì)量的量化標(biāo)準(zhǔn),。RIN為8-10，則表示RNA質(zhì)量非常好,；當(dāng)RIN值低于7,，則說(shuō)明RNA可能有降解,，可能會(huì)導(dǎo)致一些罕見(jiàn)信息的丟失等問(wèn)題。RNA定量

除了掌握RNA的完整性之外,，準(zhǔn)確評(píng)估產(chǎn)量也很重要,。產(chǎn)量的準(zhǔn)確性會(huì)受到以下因素的影響：測(cè)量?jī)x器的準(zhǔn)確性、DNA的污染,、鹽的污染以及降解程度,。而為了準(zhǔn)確測(cè)量產(chǎn)量，小編我更喜歡使用Nanodrop進(jìn)行UV定量,。

該儀器不需要稀釋樣品,，并且具有非常寬的測(cè)量RNA的范圍。以小編的經(jīng)驗(yàn),，它可以準(zhǔn)確讀取到10ng / ul。而傳統(tǒng)的紫外分光光度法應(yīng)避免使用大容量的比色皿,，因?yàn)檫@需要耗費(fèi)大量的樣品,。此法的缺點(diǎn)是也可在樣品中測(cè)量基因組DNA，如果從RNA提取過(guò)程殘留鹽或酚,，則會(huì)增加吸光度,，使得RNA的OD值變得更高。

而解決此問(wèn)題一個(gè)方法是使用熒光染料,，Ribogreen是一種RNA特異性染料,，可通過(guò)熒光來(lái)測(cè)量RNA產(chǎn)量。現(xiàn)在,，Nanodrop已經(jīng)具備檢測(cè)Ribogreen所發(fā)出熒光的功能,。

兩步法或一步法RT-PCR

RT-PCR也分兩種類型：一步法（One-step PCR）和兩步法（Two-steps PCR），具體操作見(jiàn)下圖,。前者,，RT反應(yīng)和PCR擴(kuò)增是在同一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行的；而后者,，RT 反應(yīng)與PCR擴(kuò)增反應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行,。

盡管這兩種方法都能得到終的結(jié)果，但是每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn),。選擇哪種方法取決于各種因素,。如下總結(jié)它們的優(yōu)缺點(diǎn)。

一步RT-PCR消除了樣品轉(zhuǎn)移步驟,，不僅消除了控制物污染的潛在來(lái)源,，而且需要較少的準(zhǔn)備和操作時(shí)間。又因一步RT-PCR中所使用的引物是基因特異性的,，靈敏度高,，常用于分析低表達(dá)水平基因,。而其不足在于同一樣本中只有有限數(shù)量的目的基因被擴(kuò)增，且需要在轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增間尋找一個(gè)平衡,。

所以當(dāng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)很重要時(shí),，一般采用一步法，如檢測(cè)RNA病毒,，也適用于高通量分析,。由于該法的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率高，因而在需要測(cè)量表達(dá)水平上的細(xì)微差異時(shí),，也可采用此方法,。

而兩步RT-PCR可將大批量的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后儲(chǔ)存cDNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),，可檢測(cè)大量基因,；在分別優(yōu)化RT和PCR步驟后，可更好地控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程,；又因只有少量的轉(zhuǎn)錄本被用于PCR,，則可能從RNA 分離到RT反應(yīng)的抑制劑（如乙醇、酚及胍鹽等）都被稀釋了,。

但是兩步RT-PCR更耗費(fèi)時(shí)間,，且?guī)?lái)污染的可能性更高；RT過(guò)程應(yīng)以相同效率反轉(zhuǎn)錄RNA,，否則會(huì)影響qPCR的啟動(dòng)效率,，進(jìn)而帶來(lái)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此對(duì)于每個(gè)RT反應(yīng)應(yīng)使用相同的條件,。

如果你需要對(duì)同一樣本的多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行分析時(shí),，可選擇兩步RT-PCR。另外,，當(dāng)RNA的存儲(chǔ)是個(gè)問(wèn)題時(shí),好是進(jìn)行兩步RT-PCR,，因?yàn)閏DNA在-20℃是穩(wěn)定的。