蛋白質(zhì)含量測(cè)定法,，是生物化學(xué)研究中常用、基本的分析方法之一,。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法,，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）,、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法,。另外還有一種近十年才普遍使用起來(lái)的新的測(cè)定法，即考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）,。其中Bradford法和Lowry法靈敏度高,，比紫外吸收法靈敏10～20倍，定氮法雖然比較復(fù)雜,，但較準(zhǔn)確,，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
值得注意的是,，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì),，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，有可能得出四種不同的結(jié)果,。每種測(cè)定法都不是無(wú)缺的,，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和度,；②蛋白質(zhì)的性質(zhì),；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間,。
    folin—酚試劑法早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟,。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,，比雙縮脲法靈敏得多,，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要控制操作時(shí)間,，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式,，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多,。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子,，同樣容易干擾lowry反應(yīng),而且對(duì)后者的影響還要大得多,。考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）,，由于其突出的優(yōu)點(diǎn),，正得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用. 索萊寶公司提供的Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒可以用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定，簡(jiǎn)單快速,。

Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒 
貨號(hào)：PC0010 
規(guī)格：2500T 
保存：開封使用后請(qǐng)密封保存,，本試劑盒自訂購(gòu)之日起九個(gè)月內(nèi)有效。 
產(chǎn)品內(nèi)容： 
    組成  包裝（2500微孔)  保存   
    5×G250 染色液  100ml  2-8℃   
    PBS稀釋液  30ml  2-8℃   
    蛋白標(biāo)準(zhǔn)(5mg/ml BSA)  1ml  -20℃ 
產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 
  考馬斯亮蘭G-250 染料,，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,，使染料的大吸收峰的位置（Imax），由 465nm變?yōu)?595nm,，在一定的濃度范圍內(nèi),，測(cè)定的吸光度值 A595 與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford 法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響,，樣品中巰基乙醇的濃度可高達(dá) 1M,，二硫蘇糖醇的濃度可高達(dá) 5mM，但受略高濃度的去垢劑影響,，需確保 SDS 的濃度低于 0.1%,，Triton X-100 低于 0.1%，Tween 20, 60, 80 低于0.06%,。含去垢劑的樣品推薦使用索萊寶生產(chǎn)的 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,。 
操作說(shuō)明：操作說(shuō)明： 
  一．微孔酶標(biāo)儀法 
 1.  *溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取 10ul,，稀釋至 250ul ,，使終濃度為 0.2mg/ml。待測(cè)蛋白樣品在什么溶液中,，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋,。但是為了簡(jiǎn)便起見，也可以用 0.9%NaCl或 PBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,。 
 2. 5×G250 染色液使用前請(qǐng)顛倒 3-5 次混勻,，取 1ml 5×G250 染色液，加入 4ml 雙蒸水,，混勻成 1×G250染色液,，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。 
 3.  將標(biāo)準(zhǔn)品按 0,2,4,6,8,12,16,20 微升分別加到 96 孔板中,，加 PBS 稀釋液補(bǔ)足到 20 微升,。 
 4.  將樣品作適當(dāng)稀釋（好多做幾個(gè)梯度,，如作2 倍,、4 倍、8 倍稀釋），加 20 微升到96 孔板的樣品孔
中,。由于移液器在取小量時(shí)的誤差,，標(biāo)準(zhǔn)線前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線1/2 后,。  
 5.  各孔加入 200 微升稀釋后的 1×G250染色液,，室溫放置 3-5 分鐘。 
 6.  用酶標(biāo)儀測(cè)定 A595,，或560-610nm之間的其它波長(zhǎng)的吸光度,。 
 7.  根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。 
 二．分光光度計(jì)法 
  如無(wú)酶標(biāo)儀,，染色反應(yīng)可在離心管中進(jìn)行,，反應(yīng)液混勻后加入比色皿中，使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值,。 
步驟如下： 
   1.  取八支（或者更多）干凈的 10ml 離心管,，標(biāo)記上號(hào)。 
   2.  取 100ulBSA加入 PBS 2.4ml 稀釋至終濃度為 0.2mg/ml,。 
  3.  5×G250 染色液使用前請(qǐng)顛倒 3-5 次混勻,，取 10ml 5×G250 染色液，加入 40ml 雙蒸水,，混勻成 1×G250 染色液,，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。 
4.  按下表加入試劑(以每孔 5ml 計(jì),，多余的用來(lái)清洗比色皿) 
離心管號(hào)  1  2  3  4  5  6  7（樣品管 1） 8（樣品管 2）   9（樣品管 3）
標(biāo)準(zhǔn)蛋白 BSA  0ul  100ul  200ul  300ul 400ul 500ul 500ul 適當(dāng)稀
釋的樣品 1 
500ul 適當(dāng)稀
釋的樣品 2 
…… 
PBS  500ul  400ul  300ul  200ul 100ul 0ul  0ul  0ul   0ul 
1XG250 染色液  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml 
5.  反應(yīng) 3 分鐘后測(cè) OD 值,。為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，可每間隔 2 分鐘加一管染色液,，每間隔 2 分鐘測(cè)一管 OD
值,。如下表： 
離心管號(hào)  1  2  3  4  5  6  7  8  …… 
加染色液（分鐘）  0  2  4  6  8  10  12  14  …… 
測(cè) OD值  3  5  7  9  11  13  15  17  …… 
考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點(diǎn),，正得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用,。