在細(xì)胞培養(yǎng)中,，我們也會(huì)遇到一些大大小小的問題,，今天的技術(shù)文章中,，上海恒遠(yuǎn)為大家整理出了細(xì)胞培養(yǎng)中常見的一些問題，希望能對(duì)大家有一點(diǎn)點(diǎn)幫助,！

1.如何選用培養(yǎng)基,？
培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞,，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng),。總之,，MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng),、RPMI- 1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)的是AIM V培養(yǎng)基（SFM）
2.為什么要熱滅活血清,？ 
加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng),。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件,，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺,，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞,、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí),，推薦使用熱滅活血清。
3.L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎,？它在溶液中不穩(wěn)定嗎,？ 
L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源,、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解,，但是確切的降解率一直沒有zui終確定,。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性,。
4.GlutaMAX-I是什么,？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定,？ GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的α－氨基用L－丙氨酸來(lái)保護(hù),。一種肽酶逐漸裂解二肽,，釋放L－谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,，即使在121磅滅菌20分鐘,，GlutaMAX-I二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下,，L－谷氨酰胺幾乎*降解,。
5.為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 
酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色,，酸性時(shí)為黃色,，堿性時(shí)為紫色。研究表明,，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）,。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞,，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),，用不加酚紅的培養(yǎng)基,。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基,。
6.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？ 
用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200－2000個(gè)/毫升,，在0.1毫升的細(xì)胞中加入0.1毫升的0.4％的臺(tái)盼蘭溶液,。輕輕混勻，數(shù)分鐘后,，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞,。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭,，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞,。
7.如何消除組織培養(yǎng)的污染？
重要的培養(yǎng)污染時(shí),，研究者可能試圖消除或控制污染,。首先，確定污染物是細(xì)菌,、真菌,、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開,，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái),，檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性,，因而,，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要,。
下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟:
1 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化,、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度,。
2 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi),，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中,。例如，兩性霉素B推薦下列濃度,，0.25,，0.50，1.0，2.0,，4.0,8.0 mg/ml,。
3 每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落,，出現(xiàn)空泡,，匯合度下降和變圓。
4 確定抗生素毒性水平后,，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代,。
5 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
6 重復(fù)步驟4,。
7 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代,，確定污染是否以已被消除。
8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么,？ 
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,。盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是,，如果沒有葡萄糖的話,，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。 
9.為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀,？ 
MRC的胎牛血清 沒有預(yù)老化,，儲(chǔ)存在2－8℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素,、纖維蛋白原,、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量,。推薦在－20℃儲(chǔ)存胎牛血清,，避免反復(fù)凍融。
10. Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用,，不需要CO2培養(yǎng)箱,。原因是什么,？Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別,？ 
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高,。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,，溶液會(huì)變堿,，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在 CO2培養(yǎng)箱中保存組織,，需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織,，用Hanks液就可以了。
11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別? 
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)程序,，而且除了這些標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè),，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測(cè)：
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌體檢驗(yàn)
生物化學(xué)檢測(cè) 
激素的檢測(cè)
血紅蛋白檢測(cè)
Sf9 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)及方法學(xué)檢測(cè)
12.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么,？ 
二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性,。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性,。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前,，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子,。 
13.制備 lipid-DNA的方法會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率嗎,？ 
是的。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Reagent,，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中,，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中?；旌蟽煞N溶液在室溫下孵育15分鐘,。對(duì)于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率,。確保復(fù)合物在沒有血清的情況下形成,。孵育15分鐘后，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800μl）,。（注意以上是35mm培養(yǎng)皿使用體積）,。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個(gè)很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體,，接下來(lái)可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入,。對(duì)于每一種脂質(zhì)體的詳細(xì)的信息可以參考產(chǎn)品說(shuō)明書。 
14.我使用SF900 Ⅱ時(shí),，細(xì)胞生長(zhǎng)良好,，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時(shí)效果好？
如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白,，它將與蛋白酶一起表達(dá),，這些蛋白酶將會(huì)作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中,，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無(wú)血清配方中，蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白,。為了避免這一問題,，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物,。 
15.如何檢測(cè)內(nèi)毒素(熱源)水平,？ 
LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗(yàn)是可用的zui敏感和特異的檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內(nèi)的凝集作用,。內(nèi)毒素啟動(dòng)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)酶原系統(tǒng)（絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)）,，通過修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠,，LAL中的凝固蛋白,，從而，形成不可溶的基質(zhì),。LAL試劑緩沖的鱟（血細(xì)胞）裂解物,。
胎牛血清的內(nèi)毒素檢測(cè)是在Grand Island，按照手冊(cè)上Gel-clot 方法進(jìn)行的,。在對(duì)血清產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)前,，用無(wú)熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘,，以消除抑制劑,。（通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會(huì)抑制凝膠過程,，使內(nèi)毒素不能與LAL反應(yīng),。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。） 
16.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎,？ 
如果使用固體形式的培養(yǎng)基,，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌,。應(yīng)該避免MS培養(yǎng)基的直接滅菌,，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養(yǎng)基中,。 

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