ELISA試劑盒因為具有靈敏度高,、特異性強,，酶免疫試劑的性質(zhì)比較穩(wěn)定,，操作方法簡便快速、無放射性污染以及應(yīng)用范圍廣等很多優(yōu)點,，受到很多科研工作者的喜愛,，但是Elisa試劑盒的測定，受很多方面影響,，這也是ELISA檢測中的重要部分,，下面對其中一個影響方面加以說明。

   抗原：在ELISA中,，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗結(jié)果都有影響,。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是和穩(wěn)定的制劑,，純度和免疫原性要高。如果不純,，由于抗原中所含雜質(zhì)就會競爭固相載體上的有限位置,，降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學活性,。經(jīng)試驗證明,，適用于其他血清學試驗的抗原并非均適合用于ELISA法。因此,，對某一疾病的診斷,，必須通過實踐，才能選出適用的抗原,。對大多數(shù)傳染病和寄生蟲病的血清學診斷中所用的抗原并非要求十分嚴格,，一般能用于補體結(jié)合試驗的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超聲波抗原,、凍融抗原,、細菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）,、細菌的外毒素以及用表面活性劑(如SDS)所提取的抗原等,，在作ELISA時，必須要有1-2種試劑,、要求純化,，但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去,。此外,，對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動物的臟器等,，它們當中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì),，必須設(shè)法除去,，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的,。在用特異性抗體包被固相載體時也要提純,。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時選擇的濃度要適當。如濃度太高,，則低效價抗體可能測不出來,，或包被過量形成多層抗原吸附，故在操作過程中可能脫落從而降低敏感性和可重復性,。用zui適稀釋度抗原,，包被固相載體不僅經(jīng)濟，而且可以克服前帶現(xiàn)象,。那么用多大濃度抗原進行包被zui為合適呢,？可通過棋盤滴定法進行測定，但用單項滴定法更為簡便,，其方法是將抗原進行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板,，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育后洗滌，再加酶結(jié)合物進行反應(yīng),，經(jīng)孵育洗滌后,，加底物溶液顯色，終止反應(yīng)后分別測定O.D值,，選擇O.D值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度,。一般總是要選擇那個O.D值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度,。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2,。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的O.D值有明顯差別?？乖还滔噍d體除濃度外,，對時間、溫度,、PH均有關(guān)系,。溫度高（如37℃、45℃,、或56℃）,，包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間,。但為了方便起見,，通常采用4℃包被過夜，可使抗原吸附得更加*且均勻,。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應(yīng)板或塑料管作固相載體時,，在堿性條件下（如0.1mol/L,、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗中,，如用LPS或毒素蛋白包被時,，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10ug/ml,，而對某些病原微生物抗原以5-20ug/ml較為合適,，但均應(yīng)通過滴定。

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