一,、實驗原理

細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng),。直接從體內獲取的組織細胞進行培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當原代培養(yǎng)的細胞增殖達到一定密度后,，則需要做再培養(yǎng),， 即將培養(yǎng)的細胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養(yǎng),，為傳代培養(yǎng),，傳代培養(yǎng)的累積次數就是細胞的代數。

細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融,，實驗證明這樣可以zui大限度的保存細胞活力,。目前細胞凍存多采用甘油或DMSO作保護劑，這兩種物質能提高 細胞膜對水的通透性,，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外,，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷,。復蘇細胞應采用快速融化的方 法,，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷,。

二,、實驗方法

材料：

小鼠，生理鹽水,，100ml滅菌燒杯,，15ml離心管，培養(yǎng)皿,，滴管,，無菌鑷子、剪刀,，篩網,，泡沫板，大頭針，酒精燈,，培養(yǎng)瓶,，培養(yǎng) 液，PBS,，0.25%胰酶,，超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱,、倒置顯微鏡,，顯微鏡，計數板,，離心機,，恒溫水浴箱，冰箱（4℃,、-20℃,、-70℃）,，液氮 罐,，凍存管，凍存液,，廢液缸等,。

方法：

（1）原代培養(yǎng)：

1.取出小鼠后瀝干酒精，放入超凈臺內,，固定在泡沫板上,。

2.用鑷子提起皮膚，用解剖剪剪開皮膚一個橫切口,，將皮膚向上撕開,，然后剪開肌肉等，暴露出腹腔,，在左側找到脾臟,，用彎頭眼科鑷取出脾臟，置于無菌培養(yǎng)皿中,。

3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次,，并剔除多余無用的組織。

4.將篩網置于平皿中,，脾臟置于篩網上,，用彎頭鑷鑷住，輕輕在篩網上進行碾磨,，同時不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗,。

5.將碾磨好的細胞懸液吸入至離心管中，離心(1000rpm,5min),，吸去上清（去除血液等）,。

6.加入10ml培養(yǎng)液,，吹打混勻，取樣計數,。

7.將稀釋好的細胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中,，輕輕搖晃混勻，在培養(yǎng)瓶上,。

面做好標志,，注明細胞、組別及日期,。然后將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

（2）傳代培養(yǎng)：

1.倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代,。

2.培養(yǎng)液瓶打開后,，過酒精燈火焰，置酒精燈火焰周圍,。

3.拿出直頭滴管,，套上橡皮吸頭，過火,，放入培養(yǎng)液瓶中,。

4.打開培養(yǎng)瓶，瓶口過火,，將培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)液輕輕倒入廢液缸,，用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基。

5.培養(yǎng)瓶加入0.25%胰酶,，用量以薄薄蓋滿一層為宜,，37℃消化，倒置顯微鏡下觀察到細胞收回突起變圓時立即翻轉培養(yǎng)瓶,，使細胞脫離胰酶,，然后將胰酶倒掉，加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基,。

6.取彎頭滴管反復吹打細胞使其脫壁并分散,，再根據分傳瓶數補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，制成細胞懸液,，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中,。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉,，以利于CO2氣體的進入,，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。

7.對半貼壁培養(yǎng)細胞，不需胰酶,，直接吹打,，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中,。

（3）凍存：

1.吸取傳代后的細胞懸液,，離心，去除培養(yǎng)液,，加入凍存液,，分裝凍存管（凍存管內細胞數目一般為（5～10）×106個/ml，2ml凍存管中一般放1～1.5ml細胞）,。

2.按步凍存

o冷凍保存方法一：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/min,；當溫度達-25℃以下時，可增至-5～-10℃/min,；到-100℃時,，則可迅速浸入液氮中。

o冷凍保存方法二：冷凍管置于已設定程序之程序降溫機中每分鐘降1～3℃至-80℃以下,，再放入液氮長期保存,。

（4）復蘇：

1.取出冷凍管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化,，移入無菌操作臺內,。

2.打開凍存管,，將細胞懸液吸到離心管中。

3.1000rpm離心10分鐘,，棄去上清液,。

4.加適當培養(yǎng)液后將細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng),，第二天觀察生長情況,。